4-苯丁酸鈉可以通過多種途徑減少肺表面活性蛋白A2(SP-A2)基因突變引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白積聚.pdf

1、研究背景與目的：
　　特發(fā)性肺纖維化疾病是一種以肺泡上皮損傷，成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)增生為主要病理特征的，病因不明的，進展性，致死性的慢性肺纖維化疾病。目前，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，但是卻缺乏有效的治療手段和方法。因此，逐步探索出此類疾病的發(fā)病機制，尋找新的治療藥物和作用靶點顯得尤為重要。
　　近年的研究發(fā)現(xiàn)，肺表面活性蛋白A2（SP-A2)基因突變（密碼子198位點苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，231位點甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸）與

2、肺纖維化密切相關(guān)。我們研究表明，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞過表達突變的SP-A2基因，可以破壞蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的正常折疊，使其被蛋白質(zhì)的質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在細(xì)胞內(nèi)形成蛋白沉積（aggregates）,并可能引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進一步對特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展起到促進作用。近年研究表明化學(xué)分子伴侶(chemical chaperon)，一類具有分子伴侶功能的化學(xué)小分子物質(zhì)，可以促進未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)正確折疊，部分恢

3、復(fù)其正常結(jié)構(gòu)和功能，減少蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常沉積。因此，本課題將深入探索化學(xué)分子伴侶是否影響SP-A2突變蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成、分泌、降解和沉積等作用并進一步闡明其可能的分子調(diào)節(jié)機制，最終為探索肺纖維化發(fā)病機制及其可能的臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　方法:
　　應(yīng)用體外細(xì)胞模型，在肺腺癌細(xì)胞系(A549）和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)中過表達肺表面活性蛋白SP-A2及其突變基因，通過Western Blotting方法檢

4、測化學(xué)分子伴侶對突變蛋白在細(xì)胞中的合成、分泌和沉積等的影響。通過免疫熒光技術(shù)對4PBA處理前后的SP-A2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況進行共定位檢測；通過藥物處理（4PBA和MG-132),比較SP-A2蛋白二聚體和三聚體的形成、蛋白沉積的變化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等，進一步探討4PBA對突變SP-A2蛋白折疊、降解和對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響；在CHO-K1中，通過過表達和基因沉默技術(shù)上調(diào)或下調(diào)Grp78基因，并用4PBA處理細(xì)胞，比較SP-A2蛋白的合

5、成、分泌和沉積情況，進一步探討Grp78在4PBA抑制蛋白沉積中的作用；在CHO-K1細(xì)胞中同時過表達野生型和突變型肺表面活性蛋白A2，用4PBA處理細(xì)胞后，比較SP-A2蛋白的合成、分泌和沉積情況，探討4PBA對SP-A2基因突變引起的顯性抑制作用的影響。
　　結(jié)果:
　　化學(xué)分子伴侶減少SP-A2基因突變（G231V，F(xiàn)198S)引起的蛋白沉積；4PBA促進突變的SP-A2蛋白更好地折疊、成熟和分泌；緩解突變的SP-A2

6、（G231V，F(xiàn)198S)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積；并促進突變蛋白通過蛋白酶體途徑降解，減少蛋白沉積的形成；4PBA抑制蛋白沉積的機制至少部分通過上調(diào)Grp78的表達來實現(xiàn),但對其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達影響不顯著；突變型SP-A2對野生型呈顯性抑制作用，4PBA緩解這種作用,減少蛋白沉積。
　　結(jié)論:
　　化學(xué)分子伴侶可以影響突變SP-A2蛋白的生物功能，其中4PBA可以通過幫助突變蛋白正確折疊，利用蛋白酶體途徑降解未正確折疊和錯誤