花色苷通過AMPK減少肝臟HepG2細胞的脂肪積聚.pdf

1、肝臟是脂類合成代謝和分解代謝的中心器官。正常情況下，肝臟內(nèi)總脂肪含量占肝臟重量的4％～5％，大約是60～80克，其中半數(shù)以上為磷脂，中性脂肪甘油三酯和脂肪酸含量很少。如果肝臟內(nèi)脂肪的分解與合成代謝失去平衡，或運出發(fā)生障礙，脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)就會在肝細胞內(nèi)過量積聚。 不同病因引起肝臟脂肪積聚的機理各異，一般認為，進入肝臟的脂肪酸過多、肝內(nèi)形成的甘油三酯增多或氧化減少、脂蛋白的合成減少導致脂肪的運輸障礙等是肝臟脂肪積聚的

2、三個基本環(huán)節(jié)。 肝臟脂肪積聚會引發(fā)一系列的嚴重后果：對肝臟自身的損害，目前在脂肪肝的發(fā)病機制中廣為接受的是“二次打擊學說”，脂肪積聚引起肝臟脂肪變性，形成“第一次打擊”，在此狀態(tài)下更易于受到氧化應激等因素的“第二次打擊”，加速肝細胞受損，進展為肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌；對肝外器官的損害，非脂細胞內(nèi)堆積的脂質(zhì)極易通過非氧化代謝途徑產(chǎn)生脂肪中毒，并誘導胰島素抵抗。因脂質(zhì)異位相關(guān)代謝異?？尚纬筛喾磻灾兀涞湫痛砩窠?jīng)酰胺對胰島

3、β細胞和肝細胞等都有毒性(脂毒性)，而游離脂肪酸可直接抑制胰島素受體底物-1酪氨酸的磷酸化，造成肝臟和外周IR；對全身的損害，通過加劇代謝紊亂，促進2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發(fā)生，導致代謝綜合征相關(guān)的腫瘤和心腦血管事件高發(fā)，而這些疾病反過來又促進肝臟疾病的進展，增加惡性腫瘤和心腦血管事件的發(fā)生。因此，減少肝臟脂肪積聚不但能夠直接減輕肝臟損傷，還能夠間接改善胰島素抵抗，減緩代謝綜合征的發(fā)生和進展。目前，治療肝臟脂肪積聚的方法主要是針對原發(fā)

4、病因，包括運動和飲食療法等，臨床上也有應用藥物治療嚴重的肝臟脂肪積聚，但是大多具有一定的副作用，因而尋找安全有效的天然化學物質(zhì)意義重大。 腺苷酸激活蛋白激酶是在肝臟、心臟、骨骼肌中調(diào)節(jié)能量和代謝平衡的一種蛋白激酶，它廣泛存在于真核生物的細胞中，屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶家族成員。當代謝性應激引起細胞內(nèi)AMP／ATP比值升高時，AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游的多種靶分子，減少ATP的消耗和增加ATP的生成，即促進分解代謝；反之，當AM

5、P／ATP比值降低時，AMPK則促進合成代謝。AMPK的這一作用被形象地比喻為“調(diào)節(jié)細胞能量代謝的開關(guān)”，其本身也被稱為“細胞能量調(diào)節(jié)器”。AMPK活化后，可以促進乙酰輔酶A羧化酶磷酸化使其活性降低，減少丙二酰輔酶A合成，從而增強脂肪酸氧化限速酶——肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-I的活性，促進脂肪酸氧化。由于AMPK控制脂肪酸氧化的細胞信號途徑包括AMPK、ACC和CPI-I，又有人稱之為“AMPK-ACC-CPT-I信號通路”。除此之外，ACC也是

6、脂肪合成的限速酶，AMPK的活化還能夠減少脂肪的合成。因此，AMPK有可能是調(diào)節(jié)脂肪含量、影響脂質(zhì)代謝平衡的重要靶點，調(diào)節(jié)肝臟AMPK有可能會影響肝細胞內(nèi)的脂肪含量。 大量流行病學資料表明，植物性食物具有廣泛的促進健康和預防疾病的作用，這一方面取決于食物中營養(yǎng)素的合理構(gòu)成，另一方面取決于植物性食物中存在的大量植物化學物。植物化學物的生物學效應已經(jīng)成為目前營養(yǎng)學研究領域的重要熱點之一?；ㄇ嗨厥亲匀唤绶植甲顝V泛的水溶性植物色素之一，

7、屬黃酮類化合物，自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖苷，稱為花色苷，大部分以花和果實為可食部分的植物性膳食中都有不同程度的存在。花色苷最突出的作用就是使植物呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色，近年來發(fā)現(xiàn)其有很多獨特的生理功能，尤其是在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血管增生及抗突變等方面的生理作用引起了廣泛的關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)，富含花色苷的食物可以改善高脂誘導的小鼠肥胖，降低ApoE基因缺陷小鼠的血脂水平，減少組織中的脂肪和膽固醇沉積，促進膽固醇外流，抑制CD4

8、0誘導的內(nèi)皮細胞炎癥反應。這些結(jié)果提示我們，花色苷在防治慢性非傳染性疾病方面，可能具有潛在的功效。而本實驗室在既往的研究中也發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷提取物能夠顯著減少高脂誘導肥胖大鼠的肝臟脂肪積聚，其機制可能與上調(diào)肝臟線粒體CPT-I mRNA表達水平有關(guān)。 本次研究擬采用HepG2細胞模型，觀察花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-β-glucoside，Cy-3-g)對AMPK活化、脂肪酸β-氧化和甘油三酯含量

9、的影響，明確花色苷是否能夠通過AMPK信號通路調(diào)節(jié)HepG2細胞脂肪積聚，為花色苷在防治疾病和促進健康方面的研究和應用豐富新的內(nèi)容。 研究目的： 1.研究花色苷Cy-3-g對HepG2細胞脂肪含量的影響2.探討花色苷Cy-3-g影響HepG2細胞脂肪積聚的可能機制及其與AMPK的關(guān)系研究方法1.細胞培養(yǎng)及分組生長良好的HepG2細胞分別用1μM、10μM、100μM Cy-3-g處理1h；用不加任何干預的細胞作為對照(c

10、ontrol)，用1mM的AMPK激動劑AICAR作為陽性對照。 2.花色苷Cy-3-g對HepG2細胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影響將HepG2細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細胞用試劑盒檢測。 3花色苷Cy-3-g對HepG2細胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)的影響將HepG2細胞在無血清1640培養(yǎng)基中饑餓

11、6～8h，用花色苷干預1h，每孔加入3H-棕櫚酸2μCi／mL、L-卡尼丁(L—carnitine)1 mmol／L，孵育后吸棄培養(yǎng)基，測定3H2O放射性。 4.花色苷Cy-3-g對HepG2細胞CPT-I水平和ACC磷酸化的影響將HepG2細胞饑餓6～8h后，分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集細胞總蛋白用于Western blot檢測。 5.花色苷Cy-3-g對AMPK活性

12、的影響將HepG2細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細胞總蛋白，用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)檢測AMPK活性。 6.花色苷Cy-3-g對AMPK及其磷酸化水平的影響將HepG2細胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和lmM AICAR孵育1h后，收集細胞總蛋白用于Western blot檢測。 研究結(jié)果： 1.花色苷

13、對HepG2細胞甘油三酯含量的影響與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著減少HepG2細胞內(nèi)的甘油三酯含量(p<0.05)，甘油三酯含量分別減少了8.3％、15.8％、44.1％，呈明顯的劑量-效應關(guān)系。與AMPK激動劑AICAR相比，分別相當于1mMAICAR處理組的43.6％、92.0％和104.4％。 2.花色苷對HepG2細胞脂肪酸氧化的影響與對照組相比，100μM Cy-3-g和1mM AICA

14、R能顯著促進HepG2細胞脂肪酸氧化(p<0.01)，脂肪酸氧化水平為對照組的1.2倍，與AMPK激動劑1mMAICAR處理組相當。 3.花色苷對HepG2細胞CPT-I蛋白表達的影響與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進CPT-I蛋白的表達水平(p<0.001)，CPT-I蛋白表達水平分別為對照組的1.7倍、3.7倍和4.2倍，呈明顯的劑量-效應關(guān)系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mM A

15、ICAR處理組的43.6％、92.096和104.4％。 4.花色苷對HepG2細胞ACC磷酸化的影響與對照組相比，10gM、100pM Cy-3-g能顯著促進ACC的磷酸化(p<0.001)，ACC磷酸化分別為對照組的3.1倍和4.2倍，呈明顯的劑量-效應關(guān)系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mM AICAR處理組的57.9％和77.7％。 5.花色苷對HepG2細胞AMPK活化的影響與對照組相比，1μM、10

16、μM、100μM Cy-3-g能顯著促進AMPK的活性(p<0.001)，AMPK蛋白活性分別為對照組的1.4倍、3.6倍和5.4倍，呈明顯的劑量-效應關(guān)系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mMAICAR處理組的25.1％、64.4％和97.1％。 6.花色苷對HepG2細胞AMPK磷酸化的影響與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使顯著促進AMPK蛋白磷酸化(p<0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平

17、分別為對照組的1.4倍、2.0倍和3.0倍，呈明顯的劑量-效應關(guān)系。與AMPK激動劑AICAR相比，相當于1mMAICAR處理組的49.4％、69.5％和103.6％。 7.花色苷對HepG2細胞AMPK蛋白的影響與對照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR對AMPK蛋白表達水平無影響(p>0.05)。 結(jié)論： 1.花色苷Cy-3-g可以減少HepG2細胞脂肪積聚； 2.花