CD、TK自殺基因的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、中圖分類號：Q781；Q784Q785瀘州壓虧瓏研究生碩士學(xué)位論文CD、TK自殺基因的構(gòu)建及鑒定院(系)、所!直壓匡堂醫(yī)研究生姓名圍重學(xué)科、專業(yè)肚疸堂導(dǎo)師姓名昱筮遺熬援二OO五年五月JMl09后，接種知np抗性、IPTG、Xgal瓊脂培養(yǎng)皿，利用藍(lán)白菌斑顯色，挑選陽性重組子。取陽性克隆菌落，搖菌過夜，提純質(zhì)粒后，幺空PCR及酶切鑒定初步證實重組體后，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序認(rèn)證。該公司分別用T7及SP6通用測序引物從兩端測定基

2、因全序列，Omega基因分析軟件進(jìn)行基因序列分析。(2)以人類單純皰疹病毒I型基因組為模板，利用PCR法，在反應(yīng)條件為：50ulPCR反應(yīng)體系中含人類單純皰疹病毒I型基因組DNA模板100皿，dNTP(20mM)5叫，Mgcl220mol／L2lxl，引物各為l山(25tmaol／L)，Tag酶05山。反應(yīng)參數(shù)：94。C預(yù)變性5min后；94“C變性60S，60。C退火90S，72。C延10075S，35個循環(huán)后；72℃最終延伸20mi

3、n。擴(kuò)增出約為1100bp特異性目的片段。取含rIK基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物40ul，1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化TK基IN(1100bp)。取純化產(chǎn)物3ul加入載體PGEM—Tlul，在T4DNA連接酶作用下，18。C連接過夜，構(gòu)建PGEMTTK重組質(zhì)粒。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌JMl09后，接種Amp抗性、IPTG、Xgal瓊脂培養(yǎng)皿，利用藍(lán)自菌斑顯色，挑選陽性重組子。取陽性克隆茵落，搖菌過夜，提純質(zhì)粒后，經(jīng)PCR及酶切鑒定初

4、步證實重組體后，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序認(rèn)證。該公司分別用T7及SP6通用測序引物從兩端測定基因全序列，Omega基N1分析軟件進(jìn)行基因序列分析。結(jié)果：經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明，CD基因片段約為1284bp，TK基因片段約為1100bp，擴(kuò)增的片段大小均與預(yù)計一致。酶切鑒定顯示，重組質(zhì)粒PEGMTCD分別用BarllHI、NotI酶切，切出片段約為(CD)1200bp(PEGMT)3000bp，與預(yù)計大小一致。重組質(zhì)粒PE