南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素(Crotoxin)對人食管鱗狀細胞癌作用的實驗研究.pdf

1、目的：觀察南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）對體外培養(yǎng)的人食管癌Eca-109細胞株生長的抑制作用，體內局部用藥對荷瘤裸鼠人食管癌Eca-109細胞移植瘤的抑制作用，探討南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）的抗腫瘤作用及其可能的機制。
　　 方法：以人食管癌Eca-109細胞為實驗對象，體外培養(yǎng)人食管癌Eca-109細胞株，分別以不同濃度的Crotoxin及順鉑作用于Eca-109細胞，并設陰性對照組，通過四氮唑鹽還原

2、法（MTT）觀察Crotoxin對Eca-109細胞的生長抑制作用；倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學改變，Hoechst33342染色后熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及細胞核的變化，應用流式細胞術檢測Crotoxin對Eca-109細胞凋亡及細胞周期的影響；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）測定Crotoxin作用后Eca-109細胞內BCL-2、P15及Caspase3-P17基因擴增水平。裸小鼠肩背部皮下注射人食管癌 Eca-1

3、09細胞懸液，建立皮下移植瘤動物模型，分對照組和Crotoxin組（Crotoxin組為以生理鹽水稀釋至濃度為25-100μg/kg的Crotoxin注射液，對照組為相同劑量的生理鹽水），均為瘤周皮下注射，隔日1次，共給藥10次，停藥后次日殺死所有動物，比較移植瘤瘤重，計算抑瘤率；蛋白免疫印跡法（Westernblot）測定移植瘤內BCL-2、P15及Caspase3-P17蛋白表達水平。
　　 結果：Crotoxin對人食管癌

4、Eca-109細胞生長有抑制作用，與順鉑比較，有相似甚至更強的抑制腫瘤細胞效果（P<0.05），Crotoxin對人食管癌Eca-109細胞有誘導凋亡的作用，倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡下均能觀察到凋亡細胞的核固縮、染色質邊集、核碎裂、凋亡小體形成等形態(tài)學特征。Crotoxin可引起Eca-109細胞內P15、Caspase3-P17基因擴增增加，BCL-2基因擴增減少，流式細胞儀可檢測到Eca-109細胞的凋亡峰，Crotoxin藥物濃

5、度越大，檢測到凋亡峰的時間越早，并有G1期細胞增多。Crotoxin對人食管癌Eca-109細胞裸小鼠移植瘤生長有抑制作用，抑瘤率為35.7％（Crotoxin50ug/ml組）；Western blot檢測到Crotoxin作用后瘤體標本P15、Caspase3-P17蛋白表達升高，BCL-2蛋白表達降低
　　 結論：南美洲響尾蛇神經(jīng)毒素（Crotoxin）對人食管癌Eca-109細胞體外生長有抑制作用，其作用與誘導凋亡和G1