體外誘生PR1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性增生性疾病，目前仍缺乏有效的治療方法，復(fù)發(fā)的根源是白血病微小殘余病變(minimal residue disease，MRD)。利用T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療，是治療病毒感染性疾病和腫瘤的理想方法，但是用于治療的T細(xì)胞的特異性、親和性、分化水平和數(shù)量等限制了其應(yīng)用，如何獲得特異、高效、一定數(shù)量的T細(xì)胞是目前亟待解決的問(wèn)題。采用T細(xì)胞

2、受體(T cell receptor TCR)基因轉(zhuǎn)染的方法，將特異性高親和力TCR轉(zhuǎn)移到受體的T細(xì)胞中，可以特異性殺傷受體體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。蛋白酶3是與人中性粒細(xì)胞顆粒形成相關(guān)的分化抗原，髓性白血病患者體內(nèi)原始低分化的髓系白血病細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)蛋白酶3，提示蛋白酶3是髓性白血病相關(guān)性抗原。PR1為來(lái)自蛋白酶3的HLA-A2限制性的9肽，其序列VLQELNVTV。PR1限制性CTL細(xì)胞可殺傷髓性白血病細(xì)胞，而且其殺傷毒性與白血病細(xì)胞內(nèi)蛋白酶

3、3的表達(dá)量明顯相關(guān)，但對(duì)正常骨髓細(xì)胞無(wú)毒性。本研究的目的是制備可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體，優(yōu)化PR1肽刺激產(chǎn)生的高親和力T細(xì)胞條件，聯(lián)合四聚體技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)篩選PR1特異性高親和力T細(xì)胞，為慢性髓細(xì)胞性白血病的過(guò)繼治療清除白血病微小殘余病變奠定基礎(chǔ)。 一、可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體的制備 本室在前期工作中已成功構(gòu)建重鏈pQE31-HLA-A2-BSP和輕鏈pQE31-β2m，二者均可以在M

4、15菌株中大量表達(dá)。將誘導(dǎo)、洗滌包涵體獲得的重鏈、輕鏈蛋白與PR1肽以一定的比例加入折疊緩沖液中進(jìn)行稀釋復(fù)性，形成HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體。用HLA-I構(gòu)象特異性的W6/32單抗為一抗，間接ELISA法檢測(cè)復(fù)性前后HLA-A*0201/原肽單體。然后，將復(fù)性后單體經(jīng)Sephacryl-S300柱層析純化，利用分子篩原理收集HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的賴(lài)

5、氨酸殘基，使HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體生物素化，再次經(jīng)Sephacryl-S300柱層析純化。生物素化的HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體與熒光素(phycoerythrin或allophycocyanine)標(biāo)記的鏈霉親和素(含4個(gè)生物素化位點(diǎn))按4:1的比例結(jié)合，形成可溶性HLA-A*0201-PR1四聚體。本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體，為標(biāo)記抗原特異性T細(xì)胞，進(jìn)一步篩選研究CML相關(guān)的PR1特

6、異性T細(xì)胞提供重要工具。 二、體外誘生PR1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的研究 首先，我們制備加載PR1抗原肽的T2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，體外剌激人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，用可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體檢測(cè)PR1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，結(jié)果表明HLA-A*0201/PR1四聚體具有PR1肽表位特異性，可以采用流式細(xì)胞分析技術(shù)體外分析或分選PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。然后，用加載不同濃度PR1肽的T2細(xì)胞刺激HLA-A*02

7、01陽(yáng)性的正常人外周血淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)化加載抗原量、刺激時(shí)間、刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PR1肽加載濃度為0.5μmol/L和5μmol/L、刺激時(shí)間為21天、刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1:10時(shí)，所獲得的PR1特異性高親和力CTLs比較多。用LDH釋放試驗(yàn)對(duì)誘生PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能進(jìn)行初步驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)體外誘生PBL特異性殺傷加載PR1肽T2靶細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng)，表明體外誘生的PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞具有特異性細(xì)