枯草芽孢桿菌B-332菌株發(fā)酵條件及其抗菌物質(zhì)分離純化的研究.pdf

1、稻瘟病是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一,每年對(duì)世界水稻產(chǎn)量的影響高達(dá)30﹪,現(xiàn)有防治稻瘟病的手段多以抗性植株和化學(xué)農(nóng)藥為主,化學(xué)農(nóng)藥會(huì)造成環(huán)境的污染及生態(tài)平衡的破壞,生物農(nóng)藥具有安全、無(wú)毒副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn),大力發(fā)展生物農(nóng)藥已成為必然的趨勢(shì).因此,對(duì)水稻稻瘟病的植病生防領(lǐng)域研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.本研究以枯草芽孢桿菌B-332菌株為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)摸索該菌株搖瓶發(fā)酵工藝的技術(shù)和數(shù)據(jù),確定該菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,為該菌株

2、的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ);此外,分離純化和獲得各分離的組分,測(cè)定它們質(zhì)譜圖及抗菌活性,對(duì)解析分離各組分對(duì)稻瘟病菌抑制的作用機(jī)理,揭示該菌株該菌株對(duì)稻瘟病菌防治的深層原因具有十分重要的意義. 1.將芽孢數(shù)量作為評(píng)價(jià)發(fā)酵工藝的主要標(biāo)準(zhǔn),抗菌粗提物含量作為輔助標(biāo)準(zhǔn).采用結(jié)晶紫染色法和平板傾注法相結(jié)合的方法測(cè)量發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量,用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量發(fā)酵液中抗菌粗提物的含量.明確了發(fā)酵液中抗菌粗提物的濃度與其在272.9nm波長(zhǎng)下的吸收值

3、之間的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.06x+0.153, R<'2>為0.9994,擬和效果較好. 2.對(duì)枯草芽孢桿菌B-332菌株搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定正交優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為:豆餅粉6.0﹪、蔗糖2.5﹪、硫酸銨0.7﹪、檸檬酸三鈉0.3﹪等;培養(yǎng)條件方面,確定種齡為18h、接種量為10﹪,對(duì)裝量、溫度和轉(zhuǎn)速等條件優(yōu)化后確定裝量80mL/500mL、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min.基本明確了該綜合條件下發(fā)酵過(guò)程的參

4、數(shù)變化規(guī)律,發(fā)酵周期終點(diǎn)為 72h,此時(shí)芽孢數(shù)為 1.43×10<'11>cfu/mL,比出始條件的4.03×10<'9>cfu/mL 提高了 34.48 倍,抗菌粗提物含量達(dá)到213.82mg/mL. 3.等電點(diǎn)法提取該抗菌粗提物,即對(duì)該菌株發(fā)酵液離心后,將其pH值調(diào)至4.0,抗菌粗提物可以完全沉淀出來(lái),抗菌粗提物經(jīng)過(guò)高效液相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀的分離純化,得到5個(gè)組分,按照出峰時(shí)間順序,它們的荷質(zhì)比(m/z)分別為1045.0、1

5、057.8、1072.3、1017.5和1031.1,預(yù)測(cè)4個(gè)組分的結(jié)構(gòu)(荷質(zhì)比(m/z)為1017.5的除外),依次為Bacillomycin D(iso-C15)、BacillomycinD(50﹪-iso-C16)或Bacillomycin D(50﹪-n-C16)、Bacillomycin D(ante-iso-C17)及Bacillomycin D(n-c14),它們結(jié)構(gòu)間的區(qū)別在于相差1個(gè)或幾個(gè)-CH<,2>-基團(tuán);各組分均