Let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞生長與增殖的影響.pdf

1、目的：在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討let-7b和miR-199a對(duì)黑色素瘤增殖生長的影響。
　　 方法：首先構(gòu)建靶向let-7b和miR-199a的過表達(dá)質(zhì)粒及inhibitor干擾單鏈，運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞B16F10中，使let-7b基因和miR-199a基因過表達(dá)或表達(dá)抑制，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）驗(yàn)證對(duì)應(yīng)基因的差異表達(dá)，應(yīng)用蛋白免疫印跡方法（Western Blot）檢測(cè)相

2、關(guān)蛋白（cyclinD1、Met）的差異表達(dá)，再以MTT繪制細(xì)胞生長曲線，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，最后統(tǒng)計(jì)分析let-7b和miR-199a對(duì)B16F10細(xì)胞增殖生長的影響。
　　 結(jié)果：⑴質(zhì)粒及inhibitor轉(zhuǎn)染后，各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均可見熒光細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染成功。⑵Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，let-7b質(zhì)粒組中l(wèi)et-7b基因相對(duì)表達(dá)量（3.8776±0.1372）明顯高于空白組和空質(zhì)粒組（1.1400±0.27

3、69）（P＜0.05），let-7b inhibitor組中l(wèi)et-7b基因相對(duì)表達(dá)量（0.2057±0.0263）明顯低于空白組和inhibitor對(duì)照組（0.9760±0.2300）（P＜0.05）；miR-199a質(zhì)粒組中miR-199a基因相對(duì)表達(dá)量（2.8660±0.2821）明顯高于空白組和空質(zhì)粒組（0.9809±0.1703）（P＜0.05），miR-199a inhibitor組中miR-199a基因相對(duì)表達(dá)量（0.26

4、56±0.0253）明顯低于空白組和inhibitor對(duì)照組（0.7512±0.0690）（P＜0.05）；而空質(zhì)粒組，inhibitor對(duì)照組和空白組比較無顯著差異性（P＞0.05）。⑶Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，let-7b質(zhì)粒組中cyclinD1蛋白相對(duì)含量（2.023±0.315）與let-7b inhibitor組中cyclinD1蛋白相對(duì)含量（1.857±0.377）均明顯高于空白組（0.997±0.041）（P＜0.

5、05）；而miR-199a質(zhì)粒組中cyclinD1蛋白相對(duì)含量（1.763±0.172），空質(zhì)粒組（1.490±0.292），miR-199a inhibitor組（1.590±0.286）及inhibitor對(duì)照組（1.443±0.099）和空白組比較無顯著差異性（P＞0.05）；miR-199a質(zhì)粒組中Met蛋白相對(duì)含量（5.19±0.309）與miR-199a inhibitor組中Met蛋白相對(duì)含量（4.87±0.044）均明顯

6、高于空白組（2.2±0.198）（P＜0.05）；而let-7b質(zhì)粒組中Met蛋白相對(duì)含量（3.24±0.340），空質(zhì)粒組（2.85±0.047），let-7b inhibitor組（2.49±0.068）及inhibitor對(duì)照組（2.73±0.033）和空白組比較均無顯著差異性（P＞0.05）。⑷MTT繪制細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，let-7b質(zhì)粒組及miR-199a質(zhì)粒組生長呈下降趨勢(shì)，且到轉(zhuǎn)染后第三天，此趨勢(shì)最明顯，具有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空質(zhì)粒組及l(fā)et-7b inhibitor組，miR-199a inhibitor和inhibitor對(duì)照組細(xì)胞生長趨勢(shì)與空白組比較無顯著差異性（P＞0.05）。⑸流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，let-7b質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率（11.8±1.19）％與miR-199a質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率（11.3±1.59）％均明顯高于空白組（5.77±1.74）％（P＜0.05）；而空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率（6.75±1.59）％，l