表達(dá)ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗誘發(fā)抗腫瘤效應(yīng)與機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤基因工程疫苗是在研的常用腫瘤疫苗形式之一,其能通過(guò)基因工程技術(shù),將不同的目的基因,如細(xì)胞因子、輔助刺激分子、主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(MHC-Ⅰ)類分子等導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞,接種后改變局部微環(huán)境,增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞(A-PC)和腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)活性,解決了傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞疫苗免疫原性弱,難以誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答的弊端。惡性黑色素瘤早期即易發(fā)生轉(zhuǎn)移,手術(shù)治療效果不理想,對(duì)常規(guī)化療、放療也不敏感,但由于其具有免疫原性,可進(jìn)行

2、免疫治療。本研究向小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入白細(xì)胞介素-21(IL-21)和糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)修飾的6kD結(jié)核桿菌早期分泌靶抗原(6kD early secretary antigenic target,ESAT-6)基因制成小鼠黑色素瘤瘤苗,膜表達(dá)“人工標(biāo)記異種抗原”ESAT-6,并在接種部位分泌表達(dá)IL-21,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。具有強(qiáng)免疫原性的E

3、SAT-6借助GPI錨定表達(dá)于瘤苗細(xì)胞表面,刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)作用殺傷瘤苗,釋放抗原物質(zhì)和凋亡的瘤苗促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)對(duì)腫瘤抗原的攝取和提呈,打破機(jī)體對(duì)原發(fā)腫瘤的免疫耐受,誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)腫瘤特異性免疫應(yīng)答,通過(guò)細(xì)胞毒作用殺傷表達(dá)ESAT-6的瘤苗細(xì)胞。ESAT-6只存在于瘤苗細(xì)胞,當(dāng)瘤苗被清除后,ESAT-6的作用即停止,其副作用較小,

4、而此時(shí)抗腫瘤免疫應(yīng)答已經(jīng)通過(guò)ESAT-6的引導(dǎo)作用而建立起來(lái)。瘤苗分泌的IL-21可增強(qiáng)荷瘤鼠CTL、自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞等抗腫瘤活性。瘤苗膜表達(dá)的ESAT-6和分泌表達(dá)的IL-21分別以不同機(jī)制共同發(fā)揮誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答作用。
　　 目的:研制膜表達(dá)ESAT-6-gpi、分泌表達(dá)IL-21的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,評(píng)估其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng),并分析其作用機(jī)制。
　　 方法與內(nèi)容:

5、　　 1.構(gòu)建plRES-.ESAT-6-gpi/IL-21重組質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞,G418加壓培養(yǎng),應(yīng)用單克隆和RT-PCR方法篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞株,檢測(cè)其ESAT-6和IL-21的表達(dá)及其功能,合格的單克隆細(xì)胞做為瘤苗。
　　 2.應(yīng)用米托蒽醌(MIT)處理B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,確保瘤苗應(yīng)用的安全性和有效性。以pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫小鼠,檢測(cè)pIRES

6、-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫對(duì)B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗協(xié)同抗腫瘤免疫效應(yīng)及分析其效應(yīng)機(jī)制。
　　 3.通過(guò)小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)估B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗的安全應(yīng)用劑量。用B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫小鼠,評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫功能,觀察其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng),并通過(guò)檢測(cè)活瘤苗免疫對(duì)腫瘤細(xì)胞上皮.間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響,分析其抗腫瘤機(jī)制。

7、>　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)過(guò)雙酶切和DNA測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建了pIRES-ESAT-6-gpi和pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21兩個(gè)重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞后,篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16F10-ESAT-6-gpi和B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21單克隆細(xì)胞株,以能正確表達(dá)ESAT-6-gpi和IL-21且具有生物活性的克隆,做為實(shí)驗(yàn)用瘤苗。
　　 2.MIT可安全滅活B16F10-

8、ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,使其停止增殖,短期內(nèi)仍保持活力,表達(dá)IL-21,增強(qiáng)瘤苗免疫原性。瘤苗細(xì)胞凋亡后,膜表面的ESAT-6呈點(diǎn)簇狀分布。pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫血清能夠增強(qiáng)DC對(duì)膜表達(dá)ESAT-6瘤苗的攝取,并促進(jìn)DC的成熟。plRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫可協(xié)同B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的針對(duì)野生型B16F10細(xì)胞的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤生

9、長(zhǎng)減慢,生存期延長(zhǎng)。
　　 3.以2×105個(gè)B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫接種14只C57BL/6小鼠,60天內(nèi)沒(méi)有可見(jiàn)的腫瘤生長(zhǎng),具有可靠的安全性,并能拮抗B16F10細(xì)胞攻擊,使腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制,生長(zhǎng)緩慢,生存期延長(zhǎng)。B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,體現(xiàn)在血清抗ESAT-6抗體和IFN-γ水平增高,CDC活性增強(qiáng),脾臟和淋巴結(jié)CD8+淋

10、巴細(xì)胞比例上升,CTL和NK細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。B16F10-ESAT-6-gpi-IL-21活瘤苗免疫還能使免疫鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量減少,致使荷瘤鼠黑色素瘤TGF-β1產(chǎn)生減少,促進(jìn)miR-200c轉(zhuǎn)錄表達(dá)及下調(diào)ZEB1蛋白表達(dá),從而防止免疫鼠黑色素瘤發(fā)生EMT,使其轉(zhuǎn)移能力減弱。
　　 結(jié)論:
　　 膜表達(dá)ESAT-6-gpi和分泌表達(dá)IL-21的B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗的致瘤能力下降,安全性和