芍芪多苷抗肝纖維化作用及其主要成分芍藥苷抑制肝星狀細(xì)胞增殖的分子機(jī)制.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，是臨床治療慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外取得廣泛共識(shí)的是：肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝臟ECM的主要來(lái)源，是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，它在ECM代謝和各種細(xì)胞介質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程中處于中心地位，HSC的表型激活和過(guò)度增殖是肝纖維化形成過(guò)程的關(guān)鍵?？垢卫w維化的治療，國(guó)內(nèi)外雖有過(guò)報(bào)道，但尚未找到理想的藥物。 芍芪多苷(SQDG)是采用科學(xué)的浸提和純化技術(shù)，由白芍和黃芪混

2、合提取制成的質(zhì)量可控的天然藥物的有效部位，主要含芍藥苷、黃芪甲苷等成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SQDG對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷和卡介苗加脂多糖誘導(dǎo)的免疫性肝損傷具有保護(hù)作用，且效果優(yōu)于白芍、黃芪分別單獨(dú)提取后再混合制劑(白芍總苷+黃芪總皂苷)及單獨(dú)使用白芍總苷或黃芪總皂苷。 本實(shí)驗(yàn)采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型，首先從整體水平考察了SQDG對(duì)大鼠免疫性肝纖維化的作用；體外選用HSC-T6細(xì)胞株，從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探討

3、SQDG中有效活性成分芍藥菅(Pae)抑制HSC增殖的分子機(jī)制，觀察Pae對(duì)重組大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(rrPDGF-BB)刺激HSC-T6增殖的影響；探討G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與ERK1/2信號(hào)通路在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用及相互關(guān)系，尋找其抑制HSC增殖的作用靶點(diǎn)。 目的：采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型，從病理形態(tài)學(xué)、轉(zhuǎn)氨酶、血清纖維化標(biāo)志物、脂質(zhì)過(guò)氧化等方面，明確SQDG對(duì)大鼠免疫性肝纖維

4、化的治療作用；以肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞-HSC為突破口，觀察SQDG中主要有效成分Pae對(duì)rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)在HSC-T6增殖中的作用；探討G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與ERK1/2信號(hào)通路在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用，探討Pae對(duì)rrPDGF-BB刺激的HSC-T6 G蛋白的表達(dá)及ERK1/2通路活化的影響，并進(jìn)一步研究?jī)蓷l信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，部分闡明Pae

5、抑制HSC增殖的分子機(jī)制。 方法：大鼠腹腔注射豬血清建立免疫性肝纖維化模型，設(shè)立正常對(duì)照組、模型組、SQDG給藥組(42.5，85，170mg·kg-1)和陽(yáng)性對(duì)照秋水仙堿組(Col 0.1 mg·kg-1)。HE染色和Masson染色對(duì)肝臟組織作病理檢查。分光光度法檢測(cè)血清中轉(zhuǎn)氨酶活性和肝勻漿中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、羥脯氨酸(Hyp)含量；放免法檢測(cè)血清中透明質(zhì)

6、酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和層粘蛋白(LN)、前列腺素E2(PGE2)水平；MTT法檢測(cè)HSC增殖情況；放射性免疫法測(cè)定HSC-T6 cAMP水平；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中COX-2、Gas、Gai-1、Gai-2、Gai-3蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平的變化。 結(jié)果： 1.SQDG對(duì)豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠的保護(hù)作用SQDGX寸豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠具

7、有明顯的保護(hù)作用。 提示：SQDG可以減少纖維化大鼠ECM的生成。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SQDG顯著降低肝纖維化大鼠肝勻漿中MDA的含量，升高抗氧化酶SOD、GSH-Px活性，改善肝臟氧化狀態(tài)，還能顯著降低肝纖維化大鼠血清中升高的炎性細(xì)胞因子PGE2的產(chǎn)生。 提示：抑制氧化應(yīng)激和致纖維化炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制PDGFR-β的表達(dá)從而抑制HSC增殖可能是SQDG抗肝纖維化的部分機(jī)制。 2.SQDG對(duì)免疫性肝

8、纖維化大鼠MAPK相關(guān)蛋白磷酸化和G蛋白表達(dá)的影響在豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型大鼠中，肝組織ERK1/2、p38和JNK磷酸化程度增加，肝組織中Gas的表達(dá)明顯降低，Gai-2和Gai-3的表達(dá)明顯增加，而Gai-1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。 提示：影響MAPK和G蛋白通路的變化可能是SQDG發(fā)揮抗肝纖維化作用的重要機(jī)制之一。 3.Pae對(duì)rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響體外建立rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC

9、-T6增殖模型，結(jié)果表明Pae在12.5～200mg·L-1濃度范圍內(nèi)明顯抑制HSC-T6增殖。進(jìn)一步觀察COX-2在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用，結(jié)果表明rrPDGF-BB刺激可引起COX-2表達(dá)量持續(xù)增加，選擇性的COX-2抑制劑NS.398可以明顯抑制rrPDGF.BB誘導(dǎo)的HSC.T6增殖。Pae(50，100mg·L-1)可以明顯抑制rrPDGF-BB引起的HSC.T6 COX.2表達(dá)增加。 提示：抑

10、制COX.2的表達(dá)可能是Pae抑制HSC-T6增殖的作用機(jī)制之一。 4.Pae對(duì)rrPDGF.BB刺激的HSC.T6 ERK1/2信號(hào)通路活化的影響Western.blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rrPDGF.BB刺激HSC.T6可引起ERK1/2的迅速磷酸化，Pae(25，50，100 mg·L-1)可以抑制rrPDGF-BB引起的HSC-T6 ERK1/2的激活，降低p-ERK1/2水平。 提示：抑制rrPDGF.BB刺激的HSC

11、.T6 ERK1/2信號(hào)通路的活化是Pae抑制其增殖的主要機(jī)制之一。 5.rrPDGF.BB刺激下HSC.T6 G蛋白-AC.cAMP通路的改變及Pae的作用應(yīng)用Western-blot方法，檢測(cè)rrPDGF-BB(50 μg·L-1)刺激HSC-T6中G蛋白.AC.cAMP通路的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rrPDGF.BB可以明顯促進(jìn)Gai.1和Gai.2蛋白表達(dá)水平，但對(duì)Gai.3和Gas表達(dá)無(wú)明顯影響。同時(shí)，rrPDGF-BB可以降

12、低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性，促進(jìn)HSC-T6增殖。Pae(50，100mg·L-1)可明顯抑制rrPDGF-BB引起的Gai.1、Gai.2的表達(dá)升高，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。且相關(guān)性與回歸分析結(jié)果表明Pae抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6增殖反應(yīng)與其提高HSC-T6內(nèi)cAMP水平密切相關(guān)。 提示：下調(diào)HSC.T6 Gai蛋白的表達(dá)是Pae抑制rrPDGF-BB刺激的HSC.T6過(guò)度增殖的重要機(jī)制之一。 6

13、.rrPDGF.BB刺激下HSC-T6 ERK1/2信號(hào)通路與Gai介導(dǎo)信號(hào)通路間的關(guān)系采用Gi特異性的抑制劑PT作用于HSC-T6，結(jié)果表明PT可抑制rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC.T6的增殖及P.ERK1/2的表達(dá)，提示PT敏感的G蛋白對(duì)ERK1/2的激活具有調(diào)節(jié)作用。用MEK1/2特異性的抑制劑U0126抑制ERK1/2的激活，觀察其對(duì)rrPDGF.BB刺激下HSC.T6 PT敏感的G蛋白通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U0126對(duì)Gai.

14、1和Gai.2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。rrPDGF.BB刺激的HSC.T6細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性明顯下降，在rrPDGF.BB刺激下HSC.T6中加入U(xiǎn)0126后，對(duì)降低的cAMP水平和PKA活性沒(méi)有明顯的影響。 提示：ERK1/2可能存在于PT敏感的Gi蛋白通路的下游發(fā)揮作用。Pae可能通過(guò)下調(diào)Gai表達(dá)，進(jìn)而抑制ERK1/2的激活，發(fā)揮抑制rrPDGF.BB刺激HSC.T6異常增殖的作用。 結(jié)論：

15、1.SQDG具有明顯的抗肝纖維化作用，其機(jī)制與改善肝纖維化大鼠肝臟的氧應(yīng)激狀態(tài)、抑制炎性細(xì)胞因子的生成、抑制HSC增殖等有關(guān)。 2.rrPDGF.BB刺激可引起COX.2表達(dá)量持續(xù)增加，選擇性的COX-2抑制劑NS-398可以明顯抑制rrPDGF.BB誘導(dǎo)的HSC.T6增殖。SQDG主要成分Pae可以明顯抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 COX.2表達(dá)增加，抑制COX.2的表達(dá)可能是Pae抑制HSC.T6增殖的作用機(jī)制之

16、一。 3.rrPDGF.BB刺激HSC.T6可引起ERK1/2的迅速磷酸化。Pae(25，50，100 mg·L-1)可以抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 ERK1/2的激活，降低p-ERK1/2水平。MEK抑制劑U0126可以抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 COX-2表達(dá)增加。提示Pae可能通過(guò)抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6 ERK1/2信號(hào)通路的活化，減少COX-2的表達(dá)發(fā)揮其抑制HSC.T6增殖

17、的作用。 4.rrPDGF.BB可以明顯促進(jìn)Gai.1和Gai.2蛋白表達(dá)水平，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性，Pae可明顯抑制rrPDGF.BB引起的Gai.1、Gai.2的表達(dá)升高，且Pae抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6增殖反應(yīng)與其提高HSC.T6細(xì)胞內(nèi)cAMP水平密切相關(guān)。Pae可能通過(guò)下調(diào)HSC.T6 Gai蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路抑制rrPDGF-BB刺激的HSC.T6過(guò)度增殖。 　　5.Gi特異性的抑