人肝癌細胞Hep G2中HPV18E6和E7基因的整合.pdf

1、【背景】：
　　人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是持續(xù)嚴(yán)重的全球性健康問題。高危型HPV已被公認(rèn)是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的最重要因素之一。除了宮頸癌，在食管癌、喉癌、卵巢腫瘤、乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌中也檢測到HPV病毒基因存在。但是HPV在肝癌中的感染情況卻很少有文獻報道。
　　【材料與方法】：
　　(1)HPV18在HepG2細胞的整合鑒定。首先用免疫組織化學(xué)(IHC)Anti-Hepatocyte抗體鑒定HepG2為肝細胞

2、。然后PCR擴增HPV18E6E7基因，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后測序鑒定。熒光原位雜交(FISH)檢測整合的原位信號，而Alu-PCR鑒定HPVE6E7整合的基因毗鄰位點。
　　(2)整合的HPV18E6E7對HepG2細胞致癌機理及其信號通路。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和免疫印跡(Westernblot)分別檢測E6和E7轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達。RNAi和基因芯片(RealTimePCRArray)來研究下調(diào)癌基因E7對肝癌細

3、胞HepG2的增殖和凋亡的影響及可能的信號通路。針對HPV18E7基因編碼區(qū)，設(shè)計并合成3對靶向的siRNA寡核苷酸(HPV18E7-63、HPV18E7-74和HPV18E7-112)。應(yīng)用熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)來檢測序列的轉(zhuǎn)染效率。對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化后，siRNA寡核苷酸經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后E6和E7轉(zhuǎn)錄水平的表達情況。EdU染色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染后細

4、胞的增殖和凋亡情況。構(gòu)建pGPHI/GFP/Neo-shRNA載體并篩選單克隆細胞群。人細胞周期和凋亡信號通路基因芯片檢測下調(diào)E7后增殖和凋亡相關(guān)基因的變化。
　　(3)HPV16/18在臨床肝癌標(biāo)本的感染情況。原位雜交檢測肝癌組織芯片的HPV16/18的陽性率。
　　【結(jié)果】：
　　(1)HPV18E6E7引物在預(yù)期位置(847bp)擴增出目的條帶，測序結(jié)果與GenBank中HPV18(X05015)比對匹配率達99

5、％。IHC表明HepG2細胞為肝細胞。FISH表明HepG2細胞中期和間期都有HPV18的原位雜交信號出現(xiàn)。
　　(2)RT-PCR和Westernblot證實HPV18E7在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有表達，而E6在轉(zhuǎn)錄水平有表達但蛋白水平表達較弱。熒光FAM-siRNA證實了轉(zhuǎn)染效率可達90%。在三對siRNA序列中，HPV18E7-63和HPV18E7-112被證實有效。EdU染色法結(jié)果顯示，實驗組E7-siRNA轉(zhuǎn)染48h，60h和

6、72h后S期細胞分別為9.39%±3.55%,17.29%±5.85%和30.87%±4.26%，而對照組NC-siRNA分別為18.74%±6.66%,24.03%±5.35%和41.97%±8.73%(p＜0.05)。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測顯示：實驗組細胞組24h、48h和72h細胞的總凋亡率分別為7.26%±0.29%,22.03%±0.23%和19.20%±0.78%，與對照組細胞的總凋亡率5.25%±0.7

7、6%相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。RealTimePCRArray篩查出了相關(guān)基因的改變包括CyclinH,UBA1,E2F4,p53,p107,FASLG,NOL3和CASP14等。
　　(3)原位雜交篩查肝癌芯片標(biāo)本為9%(9/100)的標(biāo)本感染HPV16/18。
　　【結(jié)論】：
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)HPVE6和E7基因能整合到人肝癌細胞HepG2中并且表達E6和E7癌蛋白。RNAi能抑制E6和E7的表達，抑