在Hep G2細胞中利用siRNA沉默GFP基因的實驗探討.pdf

1、針對同源序列的siRNA能高效、特異性沉默靶基因mRNA，而不影響細胞其他的基因功能，是治療腫瘤和病毒感染性疾病最有前景的基因治療方法之一。本研究采用siRNA/脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染，在肝癌細胞Hep G2中導入特定的siRNA，研究其在Hep G2細胞中的細胞毒性、轉(zhuǎn)染效率和該siRNA對靶基因的沉默效果，建立一種有效的基因沉默途徑，為肝癌的治療和基礎研究提供參考。
　　 目的：在Hep G2細胞中利用siRNA沉默GFP基因，研究

2、其生物學指標，為后續(xù)的實驗和臨床研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)通過實驗，對siRNA和siRNA脂質(zhì)體復合物的穩(wěn)定性和細胞毒性進行評估；
　　 (2)通過熒光標記技術(shù)，研究不同時間siRNA脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率；
　　 (3)通過熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞和RT-PCR檢測靶基因mRNA表達，確定不同種類、形式、劑量的siRNA對靶基因的沉默效能。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在不含血

3、清的DMEM培養(yǎng)液中，siRNA和siRNA脂質(zhì)體復合物可穩(wěn)定至4h,在5%血清中2～4h后明顯降解；
　　 (2)100nM的siRNA和siRNA脂質(zhì)體復合物無明顯細胞毒性；
　　 (3)siRNA脂質(zhì)體復合物轉(zhuǎn)染細胞株的效率隨時間不同而不同，4h可達90%；
　　 (4)非特異性siRNA和siRNA脂質(zhì)體復合物無沉默靶基因表達作用，特異性siRNA/脂質(zhì)體對靶基因的沉默作用在一定范圍內(nèi)隨劑量升高（20nM