CD4+T細胞在吸煙相關性牙周炎牙槽骨骨吸收作用機制研究.pdf

1、牙周炎是口腔常見疾病之一,是一種以牙齒支持和連接組織喪失為特征的慢性感染性疾病,是包括菌斑在內的局部刺激因素引起的直接細胞毒作用及蛋白分解作用,以及宿主對持續(xù)存在菌斑微生物的免疫應答所引起間接損傷的結果。牙周炎病因不明,近來大量研究表明,自身免疫反應在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,而CD4~+T細胞,即輔助性T細胞(T helper, Th),作為機體免疫調節(jié)中的核心細胞,在機體免疫應答中發(fā)揮著關鍵作用。牙周炎的全身易感因素包括遺傳

2、因素、性激素、吸煙及有關的系統(tǒng)性疾病等,其中關于吸煙影響牙周炎發(fā)生發(fā)展的研究較多,但其具體機制仍不明確。課題組前期研究發(fā)現在大鼠牙周組織和人牙周膜細胞(human periodontalligament cells, hPDLCs)存在煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7nicotinicacetylcholine receptor,α7nAChR)的功能性表達,尼古丁作用后,α7nAChR表達升高,這一效應可以被特異性拮抗劑α-銀

3、環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)所拮抗。另有研究表明,尼古丁、α7nAChR與CD4~+T細胞之間存在著密切的聯(lián)系。這些研究為我們研究尼古丁在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的思路:尼古丁激活人牙周膜細胞膜上α7nAChR后是否會通過CD4~+T細胞進一步對牙周組織產生破壞作用?其免疫分子機制是什么?目前尚未見相關報道。
　　本研究將深入探討CD4~+T細胞介導的免疫調節(jié)與吸煙相關性牙周炎的密切關系,以期闡明機體

4、的免疫應答在吸煙相關性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。
　　實驗一人牙周膜細胞的體外培養(yǎng)及CD4~+T細胞的分選1材料與方法:
　　取因正畸減數拔除的健康無齲第一前磨牙,無菌條件下采用組織塊法進行原代培養(yǎng);待組織塊周圍爬出細胞并增殖后,常規(guī)傳代,用于下一步實驗。抽取健康成年非吸煙志愿者外周靜脈血10ml,密度梯度離心法分離單個核細胞,CD4-FITC抗體染色,孵育,流式細胞儀分選CD4~+T細胞。
　　結果:組織塊培養(yǎng)約八

5、天后,其邊緣陸續(xù)有成纖維樣細胞爬出,傳代后顯微鏡下觀察細胞呈長梭形,貼壁生長,輪廓清晰,排列成放射狀。抽取外周血,密度梯度離心法成功分離單個核細胞,顯微鏡下觀察,細胞形態(tài)呈圓形,在培養(yǎng)液中懸浮生長;CD4-FITC抗體染色,孵育,流式細胞儀分選,成功分選CD4~+T細胞:分選前,CD4~+T細胞在體系中約占33.3％,分選后,CD4~+T細胞在體系中約占98.2％。3結論體外成功培養(yǎng)hPDLCs,成功分選出CD4~+T細胞,建立實驗所需

6、的細胞模型。實驗二尼古丁對與/不與CD4~+T細胞共培養(yǎng)人牙周膜細胞M-CSF、RANKL及OPG表達的影響1材料與方法選取第5代hPDLCs接種于六孔板,分別給予激動劑尼古丁(10-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M);采用實時定量PCR和Western blot實驗檢測各組細胞M-CSF、RANKL和OPG的mRNA和蛋白表達情況。2結果實時定量PCR結果表明:非共培養(yǎng)條件下,與對照組相比,10-5M尼古丁明顯上調人牙周膜細胞

7、RANKL、M-CSF mRNA表達,明顯下調OPGmRNA表達,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下10-5M尼古丁進一步上調人牙周膜細胞RANKL mRNA表達,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),M-CSF、OPG mRNA表達水平與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);Western blot的結果表明:非共培養(yǎng)條件下,10-5M尼古丁明顯上調人牙周膜細胞RANKL蛋白表達,明顯下調OPG蛋

8、白表達(P＜0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下10-5M尼古丁進一步上調人牙周膜細胞RANKL蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),OPG蛋白表達水平與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:PCR和Western blot的結果顯示:與對照組相比,尼古丁作用后,RANKL、M-CSF的表達升高,OPG的表達降低,RANKL/OPG比值升高;與CD4~+T細胞共培養(yǎng)后RANKL的表達進一步升高,

9、OPG表達水平與非共培養(yǎng)組類似,RANKL/OPG比值進一步升高;說明尼古丁可上調人牙周膜細胞促進破骨細胞分化細胞因子的表達,下調抑制破骨細胞分化細胞因子的表達,增強其誘導骨吸收的能力;與CD4~+T細胞共培養(yǎng)后,可能通過它們之間的相互作用,進一步增強其誘導骨吸收的能力。實驗三尼古丁對與/不與hPDLCs共培養(yǎng)CD4~+T細胞遷移能力的影響1材料與方法選取狀態(tài)良好的CD4~+T細胞接種于24孔板,分別給予α7nAChR激動劑尼古丁(10

10、-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M),利用Transwell遷移小室觀察尼古丁作用下CD4~+T細胞遷移能力改變。
　　結果:
　　Transwell遷移實驗表明:非共培養(yǎng)條件下,與對照組相比,10-5M尼古丁明顯增強CD4~+T細胞遷移能力,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),α-BTX+尼古丁處理組CD4~+T細胞遷移能力與對照組類似,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下,10-5M尼古

11、丁進一步增強CD4~+T細胞遷移能力,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),α-BTX+尼古丁處理組細胞遷移能力與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　Transwell遷移實驗顯示:與對照組相比,尼古丁可明顯增強CD4~+T細胞遷移能力;與hPDLCs共培養(yǎng)后,CD4~+T細胞的遷移能力進一步增強;說明尼古丁可促進CD4~+T細胞的遷移,提示可能會加重局部炎性反應,與hPDLCs共培養(yǎng)后,可能通過