NF-κB沉默對鼻咽癌5-8F細(xì)胞生物學(xué)作用研究.pdf

1、目的:構(gòu)建人NF-κB基因小干擾RNA(siRNA)重組質(zhì)粒表達(dá)載體，沉默人鼻咽癌5-8F細(xì)胞中NF-κBp65基因的表達(dá)，探明NF-κB在鼻咽癌中的生物學(xué)作用，為鼻咽癌防治提供實驗依據(jù)。
　　方法:(1)根據(jù)GenBank中人NF-κBp65的表達(dá)序列，設(shè)計、合成NF-κB特異性干擾序列(siNF-κB)，同時合成陰性序列(HK)，合成的干擾序列的正義鏈和反義鏈退火合成雙鏈DNA干擾片段，將干擾DNA片段亞克隆到pGenesil

2、-1.2質(zhì)粒表達(dá)載體上，構(gòu)建重組NF-κBp65特異性抑制的質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-1.2-NF-κB和重組陰性表達(dá)質(zhì)粒載體pGenesil-1.2-HK。
　　(2)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)載體（pGenesil-1.2-NF-κB、pGenesil-1.2-HK）分別轉(zhuǎn)入JM109菌株進(jìn)行擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并純化。
　　(3)應(yīng)用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒表達(dá)載體（pGenesil-1.2-NF-κB、pGenesil-1.2-

3、HK）分別轉(zhuǎn)染人鼻咽癌5-8F細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，分析轉(zhuǎn)染效率。
　　(4)實驗設(shè)空白對照組（未轉(zhuǎn)染載體的5-8F細(xì)胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-HK質(zhì)粒表達(dá)載體的5-8F細(xì)胞），實驗組（轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達(dá)載體的5-8F細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染48h后采用Westernblotting方法檢測鼻咽癌細(xì)胞中NF-κBp65基因的蛋白表達(dá)水平。采用MTT及流式細(xì)胞儀分析NF-κB沉默對鼻咽

4、癌5-8F細(xì)胞的增殖抑制作用以及對細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建pGenesil-1.2-NF-κB重組質(zhì)粒表達(dá)載體。(2)與對照組和陰性對照組比較，轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-NF-κB重組質(zhì)粒表達(dá)載體的5-8F細(xì)胞，NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降，對照組與陰性對照組比較，5-8F細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)無明顯差異。說明NF-κBp65siRNA能抑制5-8F中NF-κBp65的表達(dá)。
　　(3)轉(zhuǎn)入p

5、Genesil-1.2-NF-κB重組質(zhì)粒表達(dá)載體的5-8F細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率為(58.43±1.24)％，與空白對照組抑制率(0)和陰性對照組抑制率(17.89±4.13)％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。S期細(xì)胞為(42.27±0.39)％，與空白對照組(11.3±0.79)％和陰性對照組(34.88±0.85)％比較，差異具有顯著性(P＜0.05)，細(xì)胞阻滯于S期。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了NF-κBp65抑制的si