鼻咽癌細胞系5-8F中SP亞群的檢測及其生物學功能的分析.pdf

1、背景:
　　 腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細胞,具有正常干細胞相似的特性--自我更新的能力和多向分化的潛能,是腫瘤增殖生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源。什么是腫瘤干細胞?目前認為腫痛干細胞具有如下幾個特點:(1)腫瘤組織中的極少量腫瘤細胞,具有強大的致瘤,轉(zhuǎn)移和耐藥能力。(2)無限的自我更新能力,腫瘤干細胞能夠產(chǎn)生與上一代完全相同的子代細胞。(3)分化能力,腫瘤干細胞除了自我更新之外,還能夠產(chǎn)生不同表型的腫瘤細胞,能夠在體內(nèi)

2、形成新的腫瘤。(4)具有與非致瘤細胞(non tumorigenic cells)不同的表面標志?，F(xiàn)今,人們已成功的從急性髓性白血病,多發(fā)性骨髓瘤,乳腺癌,腦腫瘤,非小細胞肺癌,黑色素瘤,前列腺痛和膀胱癌等多種類型的腫瘤患者組織中分離并培養(yǎng)出各自的腫瘤干細胞。這證明在腫瘤細胞群體中確實存在一類極少數(shù)的能使群體擴增的腫瘤干細胞。腫瘤干細胞現(xiàn)已成為腫瘤研究的熱點。目前,主要依據(jù)腫瘤細胞表面膜蛋白,粘附分子及受體的差異,通過一些假想的干細胞表

3、面標記,如CD133、CD44等分離和鑒定腫瘤干細胞。但是由于大部分的腫瘤尚缺乏特異性的表面標記,因此腫瘤干細胞的分離純化一直是長久以來亟待解決的難題之一。
　　 而側(cè)群(Side Population,SP)細胞作為一種不通過尋找特異性的表面標記,利用熒光染料外排的特性來富集腫瘤干細胞,作為研究腫瘤干細胞的方法是一種理想的途徑。SP細胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細胞外,在一步法骨髓造血干細胞分選時分離出的弱熒

4、光信號細胞群。這群細胞在總量上只占整個骨髓細胞的0.05％,但卻富含造血重建細胞,即造血干細胞。SP細胞現(xiàn)已經(jīng)在多種正常組織被發(fā)現(xiàn),如人和小鼠的骨髓、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)等。此外,實體腫瘤標本以及腫瘤細胞系,如胃癌,前列腺癌,肺癌,膠質(zhì)母細胞瘤等都可檢測分離出SP細胞。但是在Wilms瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌細胞株HepG2和Huh6 中卻沒發(fā)現(xiàn)SP。研究表明,SP細胞具有自我更新,多向分化潛能和修復組織的功能,腫瘤細胞株中的SP細胞還

5、具有強大的致瘤能力和耐藥能力,可能是腫瘤復發(fā)和耐藥的根源。SP細胞高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassettetransporter)家族成員ABCG2/Bcrpl(ATP-binding cassette superfamily Gmember2/breast cancer resistance protein 1),并大多同時表達有相應干細胞的標記分子。ABCG2/BCRP1定位于細胞膜,具有“泵”的功能,因此SP

6、細胞可將許多細胞毒化療藥物排出細胞外,從而使腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加ABCG-2/BCRP-1的表達可以使SP數(shù)量明顯增加。接種免疫雙缺陷品系的NOD/SCID鼠后顯示,SP細胞具有極強的成瘤能力。目前來說,在缺乏顯著的干細胞分子標記的情況下,SP細胞可作為研究腫瘤干細胞的一種重要途徑。
　　 本課題利用實驗室現(xiàn)有的FACS Aria的流式細胞儀,檢測鼻咽癌細胞系5-8F中是否存在SP細胞亞群?如存在,SP與

7、一些干細胞表面標記物之間的相互關(guān)系,并在體內(nèi)外鑒定其生物學功能,分析其是否具有腫瘤干細胞的特性,并在臨床標本中得到進一步驗證。建立一個檢測和分離鼻咽癌干細胞的方法和平臺,為繼續(xù)深入探討鼻咽癌的病因、發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移、復發(fā)、耐藥等奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 一.鼻咽癌細胞系5-8F中SP細胞染色條件的優(yōu)化熒光染料Hoechst33342孵育不同的時間和終濃度,利用流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡共同分析,探討獲得SP細胞所需

8、熒光染料Hoechst33342孵育的最佳時間和最合適的終濃度。研究細胞生長密度,孵育環(huán)境對SP細胞比例的影響。
　　 二.流式細胞儀檢測SP細胞中ABCG2,CD133的表達,分析SP細胞與各表面標記物之間的相互關(guān)系熒光標記的抗體PE-ABCG2,CD133與熒光染料Hoechst33342共同染色,流式細胞儀分析幾者之間的關(guān)系。
　　 三.細胞的分選和純度鑒定利用流式細胞儀分選SP和MP細胞,倒置熒光顯微鏡和流式細胞

9、儀對所分選的細胞進行純度鑒定。
　　 四.Real-time PCR檢測SP細胞中ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族,干性相關(guān)等基因的表達流式細胞儀分選出SP和MP細胞,抽提RNA,跑膠鑒定RNA的純度和濃度,選取質(zhì)量好的RNA,qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達。
　　 五.SP細胞的生物學功能分析
　　 1.通過平板克隆形成試驗,MTT檢測生長曲線法比較SP和MP細胞體外的自我更新與自我增殖能力。同時,MTT檢測比較SP和MP

10、細胞耐藥能力。
　　 2.分化潛能的測定:分選出SP和MP細胞體外培養(yǎng)段時間后,重新Hoechst33342熒光染料染色,流式細胞儀分析SP細胞亞群比例的變化。
　　 3.Boyden小室侵襲試驗及Transwell體外遷移試驗分析SP細胞亞群的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.流式細胞儀分析SP和MP細胞的細胞周期。
　　 5.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗:不同數(shù)量的SP和MP細胞梯度2×105,1×105,1×104和

11、5000個皮下種植裸鼠,4W后觀察成瘤率。瘤組織HE染色,鏡下觀察結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 一.鼻咽癌細胞系5-8F中SP細胞所需熒光染料Hoechst33342最佳的孵育時間為70 min,最合適的孵育濃度為3mg/L。SP亞群比例為2.3％。不同的孵育環(huán)境影響SP的檢測。一定程度上,SP細胞的比例呈密度依賴。
　　 二.流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡鑒定,分選SP和MP細胞的純度達到98％以上,為進一步研究SP

12、細胞提供生物學功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 三.SP和MP細胞體內(nèi)外功能試驗具有明顯的差異。SP細胞是一類處于相對靜息期的細胞,體外培養(yǎng)具有自我更新,自我增殖和多向分化潛能,以及強大的致瘤和侵襲,轉(zhuǎn)移能力。具有腫瘤干細胞樣特性。
　　 四.SP細胞富集表達干細胞相關(guān)基因。高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員ABCG2等,與腫瘤耐藥性密切相關(guān)。
　　 五.已證實的其他腫痛的表面標記物卻并未富集在SP細胞中,推測膜表面蛋白CD13