NF-κB-p65在EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞干性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種源發(fā)于鼻咽部的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能，治療后部分病例容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，盡管放療技術(shù)不斷發(fā)展，鼻咽癌治療療效較十年前有一定的提高,但尚未取得滿意療效。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）理論從新的視角為鼻咽癌發(fā)生和復(fù)發(fā)機(jī)制提供了合理的解釋,認(rèn)為鼻咽癌易局部侵襲、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性與鼻咽癌干

2、細(xì)胞“干性”密切相關(guān)，靶向去除鼻咽癌干細(xì)胞，可能是一種“根治”性新策略。核轉(zhuǎn)錄因子κB( nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)為鼻咽癌疾病LMP1（EB病毒編碼的潛伏性膜蛋白1）所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的信號(hào)傳導(dǎo)樞紐，它作為核轉(zhuǎn)錄因子能與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域的特定序列κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡及放化療抵抗等生物特性的功能。而信號(hào)

3、傳導(dǎo)中這種基因與基因功能區(qū)特異性序列相互結(jié)合及作用很可能為腫瘤發(fā)病中的關(guān)鍵機(jī)制及脆弱點(diǎn)。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌干細(xì)胞中NF-κB持續(xù)激活入核，同時(shí)高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1，但 NF-κB對鼻咽癌干細(xì)胞生物特性的具體調(diào)控功能及其與干細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系目前尚不清楚，揭示這一病理機(jī)制，將為鼻咽癌治療提供新靶點(diǎn)和思路。研究顯示綠茶在防治癌癥疾病中展現(xiàn)良好潛能，其中表沒食子兒茶素沒食子酸脂（Epigallocatechin-

4、3-gallate，EGCG）是綠茶多酚成分防治癌癥的主要成分，其具有低毒、高效的靶向性特點(diǎn)，其抗癌機(jī)制與影響NF-κB通路活性密切相關(guān)，但EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及具體機(jī)制尚不明確。本論文研究NF-κB/p65對鼻咽癌干細(xì)胞“干性”的功能調(diào)控并探索其調(diào)控機(jī)制與轉(zhuǎn)錄表達(dá)干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的關(guān)系；并以此為靶向切入點(diǎn)，研究 EGCG靶向抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及分子機(jī)制，旨在為完善鼻咽癌干細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供一定理論

5、依據(jù)，為挖掘低毒、高效的天然植物小分子靶向腫瘤干細(xì)胞的治療策略奠定實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1．鼻咽癌干細(xì)胞球的分離并鑒定其干性的研究
　　在優(yōu)化以往實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上采用無血清懸浮成球法從鼻咽癌細(xì)胞系 CNE2及 C666-1中富集能穩(wěn)定傳代的人鼻咽癌微球體；通過 MTT實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌成球細(xì)胞的增殖能力及化療藥物順鉑的耐受性；軟瓊脂克隆球形成實(shí)驗(yàn)檢測其克隆形成能力；Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌成球

6、細(xì)胞的侵襲能力；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其體內(nèi)成瘤能力；通過細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞儀分析干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的表達(dá)情況；Real Time PCR及Western blot于基因蛋白水平檢測EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的表達(dá)情況。
　　2、NF-κB/p65調(diào)控鼻咽癌干細(xì)胞的作用及機(jī)制研究
　　通過構(gòu)建NF-κB/p65慢病毒沉默鼻咽癌干細(xì)胞中p65的基因表達(dá)，再結(jié)合以上一系列的功能實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克

7、隆球形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)）檢測沉默NF-κB/p65的表達(dá)對鼻咽癌干細(xì)胞增殖、耐藥、侵襲、成瘤等生物特性的影響；再通過Real Time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測沉默p65后EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因Bmi-1、Twist1的表達(dá)差異，最后構(gòu)建Twist1啟動(dòng)子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)鼻咽癌干細(xì)胞球，用雙熒光素酶檢測沉默p65后Twist1啟動(dòng)子活性的變化。
　　3、EGCG抑制 NF-κB/p

8、65活性調(diào)控鼻咽癌干細(xì)胞干性的作用及機(jī)制研究
　　EGCG各濃度干預(yù)鼻咽癌干細(xì)胞球后，通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆球形成實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤等生物特性功能的影響；通過流式細(xì)胞儀分析 EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例的影響；利用細(xì)胞免疫熒光、Real Time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)于細(xì)胞分子水平檢測EGCG對NF-κB/p65活性、EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞因子Bmi-

9、1、Twist1蛋白及基因表達(dá)的影響；再通過雙熒光素酶分析檢測EGCG對p65所調(diào)控的Twist1啟動(dòng)子活性的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1．無血清懸浮培養(yǎng)富集獲得具有干細(xì)胞生物特性的鼻咽癌干細(xì)胞球
　　采用無血清懸浮培養(yǎng)成球法從人源化鼻咽癌細(xì)胞系 CNE2(低分化鱗癌)、C666-1(未分化型癌)中成功分離獲得鼻咽癌球細(xì)胞CNE2-SC(CNE2 sphere cells)及 C666-1-SC(C666-1 sph

10、ere cells)。將CNE2-SC及C666-1-SC重置于含10％的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其能分化為與親本細(xì)胞相同特性的貼壁細(xì)胞；免疫熒光結(jié)果提示：CNE2-SC及C666-1-SC較其親本細(xì)高表達(dá) CD44；FACS檢測分析鼻咽癌球細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例，結(jié)果顯示：CNE2-SC較CNE2 CD44+細(xì)胞比例（89.09±2.0%vs4.81±2.01%）及C666-1-SC較C666-1 CD44+細(xì)胞比例（87.21±3.24%

11、vs5.49±1.65%）均明顯偏高，具有顯著差異性（P<0.01）。qRT-PCR和Western blot檢測干細(xì)胞基因及EMT標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示：與親本細(xì)胞比較，CNE2-SC、C666-1-SC細(xì)胞中Twist1、Bmi1及間葉標(biāo)志物N-cadherin Vimentin的mRNA表達(dá)均顯著增高（P<0.01)，而上皮標(biāo)志物 E-cadherin的 mRNA表達(dá)偏低(P<0.05)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示以上指

12、標(biāo)蛋白表達(dá)差異與基因表達(dá)情況相符。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：與親本細(xì)胞比較，CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞增殖活性及對順鉑耐受性更強(qiáng)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CNE2-SC比CNE2的穿膜細(xì)胞數(shù)為268±6個(gè)/視野 vs76±7個(gè)/視野；而 C666-1-SC比C666-1的穿膜細(xì)胞數(shù)為258±8個(gè)/視野vs68±7個(gè)/視野，前者均明顯偏高，具有顯著性差異（ P<0.01)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：CNE2-SC、C66

13、6-1-SC分別比較CNE2及C666-1的克隆形成率為28±4%vs8±3%和26±3%vs7±2%，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：1×104個(gè)CNE2-SC細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)即能起始腫瘤的發(fā)生，在相同細(xì)胞數(shù)量時(shí)，CNE2-SC較CNE2成瘤體積更大,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2. NF-κB/p65在鼻咽癌干細(xì)胞球中激活，沉默其表達(dá)能抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤、耐藥
　　Wester

14、n blot檢測鼻咽癌干細(xì)胞球與親本細(xì)胞 NF-κB/p65表達(dá)差異，結(jié)果顯示：與CNE2及C666-1比較，CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且p65抑制物Ikba的磷酸化蛋白P-Ikba表達(dá)也明顯增強(qiáng)。細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn) NF-κB/p65于 CNE2及C666-1中主要表達(dá)定位于胞漿，而于CNE2-SC及C666-1-SC中核轉(zhuǎn)位主要表達(dá)定位于細(xì)胞核。構(gòu)建 p65三個(gè)序列的干擾慢病毒載體對C

15、NE2-SC、C666-1-SC進(jìn)行轉(zhuǎn)染、內(nèi)源性篩靶、獲得穩(wěn)定干擾鼻咽癌干細(xì)胞株shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC；通過Western blot驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株p65干擾效率，結(jié)果示：shp65-CNE2-SC及shp65-C666-1-SC與對照干擾組（Scr組）比較，P65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株克隆形成能力，結(jié)果提示：shp65-CNE2-SC、shp65-

16、C666-1-SC分別較對照干擾細(xì)胞Scr-CNE2-SC、Scr-C666-1-SC的克隆球形成率均明顯降低，具有顯著差異性（P<0.01），且克隆球體變??；Transwenll小室實(shí)驗(yàn)檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株侵襲力變化，結(jié)果提示：shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC分別較Scr-CNE2-SC及Scr-C666-1-SC的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，具有顯著性差異（ P<0.01）。MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度順鉑對 shp

17、65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC、Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC增殖抑制效應(yīng)，結(jié)果示：較對照干擾細(xì)胞株，shp65-CNE2-SC、shp65-C666-1-SC細(xì)胞存活比例明顯降低，具有差異性（P<0.05）。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測p65穩(wěn)定干擾細(xì)胞株體內(nèi)成瘤能力，結(jié)果示:shp65-CNE2-SC起始腫瘤的能力下降，接種1×106個(gè)細(xì)胞數(shù)量時(shí)，對照組成瘤率4/4，而shp65組成瘤率3/4，接

18、種1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)量時(shí)，對照組成瘤率4/4，而shp65組成瘤率2/4，同一細(xì)胞數(shù)量級比較，shp65組形成移植瘤的重量減低，具有統(tǒng)計(jì)差異性（P<0.05）。
　　3.沉默NF-κB/p65表達(dá)抑制鼻咽癌干細(xì)胞球EMT及Twist1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
　　Western blot檢測沉默P65表達(dá)對鼻咽癌干細(xì)胞EMT標(biāo)志物及干細(xì)胞基因表達(dá)的影響，結(jié)果示：與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較，shp65-CN

19、E2-SC和shp65-C666-1-SC的EMT標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)下降，而E-cadherin表達(dá)上升(P<0.05，P<0.01)，即 EMT過程受到抑制；與 Scr-CNE2-SC和 Scr-C666-1-SC比較， shp65-CNE2-SC和shp65-C666-1-SC細(xì)胞中 Twist1及Bmi-1的蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)。構(gòu)建Twist1熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至P65

20、穩(wěn)定干擾細(xì)胞株及對照干擾細(xì)胞株中，熒光素酶檢測Twist1啟動(dòng)子活性結(jié)果示：與對照組比較， shp65-CNE2-SC及 shp65-C666-1-SC中Twist1啟動(dòng)子活性均降低，具有統(tǒng)計(jì)差異性(P<0.05)。
　　4．EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、成瘤能力
　　MTT實(shí)驗(yàn)檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞球細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果示：與對照組（EGCG0μM）比較，EGCG各劑量干預(yù)組細(xì)胞存活比例呈劑量依賴性降低（P<

21、0.05，P<0.01）。細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞二次成球能力的影響，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細(xì)胞二次成球率呈劑量依賴性降低(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證克隆形成能力，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細(xì)胞克隆形成能力呈劑量依賴性抑制（P<0.05，P<0.01）；transwenll小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞的侵襲能力的影響，結(jié)果示：與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)呈劑

22、量依賴性逐漸降低（P<0.05，P<0.01）。采用經(jīng)各藥物組（DMSO組，EGCG20μM組,順鉑10μM組, EGCG20μM+順鉑10μM組）干預(yù)處理48小時(shí)后的CNE2-SC（1×106個(gè)數(shù)量級）行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，分析各組成瘤時(shí)間，結(jié)果顯示：EGCG組成瘤時(shí)間與對照組（DMSO組）比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時(shí)間延遲；EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較，具有顯著差異性(P<0.01)，與EGCG或順鉑單獨(dú)干預(yù)組比

23、較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),前者成瘤時(shí)間延遲。分析各組成瘤重量結(jié)果顯示：與對照組比較，EGCG組成瘤重量偏低(P<0.05)；而與順鉑組比較， EGCG組成瘤重量無明顯差異；但EGCG聯(lián)合順鉑組與對照組比較差異顯著(P<0.01)，與各單獨(dú)干預(yù)組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。分析比較各組不同時(shí)間成瘤體積差異，結(jié)果顯示：EGCG聯(lián)合順鉑組較對照組具有顯著性差異（P<0.01)，與各單獨(dú)干預(yù)組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；

24、EGCG組與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但與順鉑組比較差異不明顯。
　　5．EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞的EMT及Bmi-1、Twist1的表達(dá)
　　運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測EGCG對CNE2-SC及C666-1-SC CD44+細(xì)胞比例的影響，結(jié)果顯示：與對照組（EGCG0uM）比較,EGCG（50μM）干預(yù)組中CNE2-SC細(xì)胞CD44+細(xì)胞比例由(90.14±3.76)%降低至(9.54±2.81)%；C666-1-

25、SC細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例由(85.04±3.30)%降低至(8.93±2.87)%，兩組干預(yù)前后比較具有顯著性差異（P<0.01）。從蛋白及基因水平驗(yàn)證 EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞 EMT及腫瘤干細(xì)胞基因的影響，RT-PCR檢測結(jié)果提示：N-cadherin、 Vimentin、CD44、Bmi-1、Twist1表達(dá)下降，而N-cadherin表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）；Western blot檢測結(jié)果提示：上述指標(biāo)蛋白表達(dá)

26、趨勢與基因表達(dá)相符（P<0.05， P<0.01）。
　　6．EGCG抑制NF-κB/p65活性及影響p65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
　　細(xì)胞免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測EGCG對鼻咽癌干細(xì)胞中NF-κB/p65活性的影響，免疫熒光檢測結(jié)果示：與對照組（EGCG0μM）比較，EGCG（25μM，50μM）各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC中NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位受抑制，核內(nèi)蛋白表達(dá)降低，且呈劑量依賴性

27、抑制效應(yīng)。Western blot檢測各EGCG干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白及胞核蛋白p65和P-p65(p65磷酸化蛋白)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：各組細(xì)胞總蛋白中 p65表達(dá)未有明顯差異；但與對照組比較， EGCG各干預(yù)組細(xì)胞核中p65蛋白表達(dá)降低，而于細(xì)胞質(zhì)中p65蛋白表達(dá)有所升高，且上述變化趨勢呈劑量依賴性（P<0.05，P<0.01）；與對照組比較，EGCG各干預(yù)組細(xì)胞總蛋白中P-p65蛋白表達(dá)呈劑

28、量依賴性減弱（P<0.05，P<0.01）。探索EGCG抑制鼻咽癌干細(xì)胞是否與影響P65對Twist1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān),通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測分析各干預(yù)組CNE2-SC及C666-1-SC細(xì)胞中Twist1啟動(dòng)子活性變化，結(jié)果顯示:與對照組（Scr組）比較，EGCG(50μM)干預(yù)組及Shp65組的Twist1啟動(dòng)子活性均減弱（ P<0.05）；而 shp65聯(lián)合 EGCG(50μM)干預(yù)組與EGCG(50μM)組或 Shp65組比較，

29、Twist1啟動(dòng)子活性減弱更明顯（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．無血清懸浮培養(yǎng)能富集具有干細(xì)胞生物特性的鼻咽癌干細(xì)胞球，其可作為理想的腫瘤干細(xì)胞研究模型。
　　2．NF-κB/p65在鼻咽癌干細(xì)胞中激活、調(diào)控 EMT及轉(zhuǎn)錄表達(dá)Twist1以維持鼻咽癌干細(xì)胞增殖、侵襲、耐藥、成瘤的生物特性。
　　3． EGCG通過抑制NF-κB/p65活性及EMT過程而抑制鼻咽癌干細(xì)胞干性。
　　4．NF-κB/p6