Stathmin siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及沉默stathmin基因?qū)Ρ茄拾?-8F細(xì)胞系細(xì)胞周期和凋亡的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建stathmin特異性siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體,探討stathmin特異性siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體對鼻咽癌5-8F細(xì)胞stathmin基因的表達(dá)是否具有沉默作用,同時(shí)研究沉默stathmin基因?qū)Ρ茄拾?-8F細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　方法:合成用于stathmin基因特異性表達(dá)的DNA干擾片段,經(jīng)退火形成雙鏈DNA片段,將獲得的雙鏈DNA片段連接到已經(jīng)線性化的質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil1.1上。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿

2、菌JM109菌株進(jìn)行篩選與擴(kuò)增,采用雙酶切和測序?qū)χ亟M的質(zhì)粒表達(dá)載體進(jìn)行鑒定。研究細(xì)胞分組:1)脂質(zhì)體組(脂質(zhì)體試劑);2)陰性對照組(轉(zhuǎn)染pGenesil1.1-HK);3)stathmin特異性組(轉(zhuǎn)染pGenesil1.1-STM),應(yīng)用脂質(zhì)體將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入鼻咽癌5-8F細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞,提取總RNA和總蛋白分別進(jìn)行RT-PCR與Western blot分析3組細(xì)胞中stathmin基因在mRNA及蛋白水平的

3、表達(dá),同時(shí)在48h后收集以上3組鼻咽癌細(xì)胞作流式細(xì)胞分析。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切和測序鑒定,插入siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的stathmin特異性堿基序列和方向正確,在mRNA及蛋白水平上均能有效降低stathmin基因在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中的表達(dá),流式細(xì)胞分析結(jié)果示STM組和脂質(zhì)體組與陰性對照組比較,G2期細(xì)胞百分比例(21.27±0.76％)和細(xì)胞凋亡數(shù)百分比例(9.20±1.03%)均顯著增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:我們