人類(lèi)胚胎干細(xì)胞-誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向成熟的嗜堿性粒細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(human embroynic stem cells，hESCs)及人類(lèi)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced human pluripotent stem cells，hiPSCs)具有無(wú)限增殖及多向分化潛能，這不僅為再生醫(yī)學(xué)研究提供了潛在的細(xì)胞來(lái)源，而且為建立疾病特異性疾病模型開(kāi)展研究，以及最終的個(gè)體化治療提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 由hESCs分化而來(lái)的造血干細(xì)胞已經(jīng)被成功地誘導(dǎo)分化為具有功能的紅細(xì)胞、中性粒細(xì)

2、胞、血小板、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、自然殺傷細(xì)胞(NK)和功能未確定的T、B淋巴細(xì)胞，而從hESCs分化誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞的相關(guān)工作至今尚無(wú)報(bào)道。嗜堿性粒細(xì)胞(basophils)是起源于骨髓多能造血干細(xì)胞，在骨髓內(nèi)分化成熟后進(jìn)入外周血的一類(lèi)細(xì)胞群。其表型及其部分特性和嗜酸性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞相似。嗜堿性粒細(xì)胞在介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)與發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用中具有重要的功能，并且在增強(qiáng)免疫應(yīng)答記憶等方面發(fā)揮作用。鑒此，探討嗜堿性粒細(xì)胞分化

3、發(fā)育途徑涉及調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和研究?jī)r(jià)值。
　　 嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞均具有相似的細(xì)胞表型和功能。這三種細(xì)胞的早期發(fā)育至今都存在著爭(zhēng)議。有研究表明，嗜堿性粒細(xì)胞早期與嗜酸性粒細(xì)胞一起發(fā)育，也有研究認(rèn)為嗜堿性粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞的早起發(fā)育是一條途徑。因此從hESCs/hiPSCs向嗜堿性粒細(xì)胞分化發(fā)育的研究將有助于解決這一科學(xué)問(wèn)題的價(jià)值。
　　 鑒此，本研究探索性建立由hESCs/hiPSCs

4、來(lái)源的、誘導(dǎo)分化成熟的嗜堿性粒細(xì)胞的培養(yǎng)方法，在此基礎(chǔ)上對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步探討。
　　 第一部分hESCs/hiPSCs向早期造血干細(xì)胞分化及其生物學(xué)特性
　　 [目的]建立hESCs/hiPSCs向早期造血干細(xì)胞分化的方法，并對(duì)hESCs/hiPSCs誘導(dǎo)分化的造血干細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行比較。
　　 [方法]①?gòu)男∈笈咛ブ蟹蛛x培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維母細(xì)胞（mouse embrynicfibroblast，MEF）

5、細(xì)胞，體外擴(kuò)增，并作為滋養(yǎng)層與人類(lèi)胚胎干細(xì)胞系(H1)，人類(lèi)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(G1、G4、B6、B7)共培養(yǎng)保持其生長(zhǎng)和未分化能力。②用未分化的hESCs/hiPSCs分別與小鼠主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成早期造血干細(xì)胞。③經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析這幾組誘導(dǎo)分化后的早期造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物特征。④經(jīng)PT-PCR檢測(cè)hESCs誘導(dǎo)的早期造血干細(xì)胞的基因表達(dá)。
　　 [結(jié)果]①經(jīng)體外分離、消化、傳代培養(yǎng)出大

6、量的MEF細(xì)胞，作為hESCs/hiPSCs的滋養(yǎng)層細(xì)胞，促使其快速生長(zhǎng)繁殖而不分化。②經(jīng)未分化的hESCs/hiPSCs與小鼠AGM成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)14d后，可以成功誘導(dǎo)出大量的早期造血干/祖細(xì)胞。③通過(guò)流式檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的早期造血干/祖細(xì)胞具有向紅系、內(nèi)皮系、髓系等細(xì)胞分化的能力，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)所采用培養(yǎng)方法能大量有效誘導(dǎo)出早期二次造血干/祖細(xì)胞。④經(jīng)過(guò)RT-PCR的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法早在共培養(yǎng)階段

7、就可以檢測(cè)到早期造血調(diào)控所必須的基因CD34、c-kit、GATA-1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了本方法誘導(dǎo)培養(yǎng)出早期造血干/祖細(xì)胞的有效性。
　　 [結(jié)論]通過(guò)hESCs/hiPSCs與小鼠AGM成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)方法可以大量、有效地誘導(dǎo)出早期的二次造血干細(xì)胞。
　　 第二部分hESCs/hiPSCs向成熟嗜堿性粒細(xì)胞誘導(dǎo)分化及生物學(xué)特性
　　 [目的]建立人類(lèi)胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞向嗜堿性粒細(xì)胞分化的方法，并鑒

8、定其極其生物學(xué)特性。探討由人類(lèi)胚胎干細(xì)胞經(jīng)分化得到的嗜堿性粒細(xì)胞的趨化能力及釋放組胺功能。
　　 [方法]①經(jīng)過(guò)不同細(xì)胞因子的三階段的誘導(dǎo)法得到一定量的含有堿性顆粒的粒細(xì)胞。②通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì);利用May-Giemasa、Toluidine blue染色對(duì)細(xì)胞大體形態(tài)染色觀察;免疫熒光染色對(duì)其細(xì)胞顆粒進(jìn)行特異性的染色，并且將其與嗜酸性粒細(xì)胞作比較，證實(shí)所誘導(dǎo)的細(xì)胞為嗜堿性粒細(xì)胞。③通過(guò)FACS和半定量

9、RT-PCR對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行表型和基因檢測(cè)，同時(shí)用嗜酸性粒細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行比較性研究。④用不同濃度的N-甲?；琢蝓?亮氨酰-苯丙氨酰胺( fMLP)，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)，F(xiàn)cεRI(CRA-1)置于transwell板下室，觀察細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞的趨化能力，并且與嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行比較研究。⑤用不同濃度的fMLP，eotaxin、FcεRI(CRA-1)置于transwell板下室，觀察嗜堿性粒細(xì)胞的趨化能力，并且與嗜

10、酸性粒細(xì)胞進(jìn)行比較研究。⑥用不同濃度的FcεRI(CRA-1)在液體培養(yǎng)第14天與第21天刺激嗜堿性粒細(xì)胞，收集上清，并裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞內(nèi)含有的因子。用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)和分泌組胺量，并算出組胺釋放率。
　　 [結(jié)果]①經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后開(kāi)始大量增殖，7天開(kāi)始增殖速度明顯加快，一般在兩周達(dá)到細(xì)胞增殖的高峰，兩周后鏡下觀察，細(xì)胞呈不規(guī)則且顆粒粗大。②May-Giemasa染色可見(jiàn)大約21.4％的細(xì)胞呈現(xiàn)胞體不規(guī)則形，胞

11、漿胞內(nèi)可見(jiàn)粗大的藍(lán)紫色顆粒，胞核為單核或者分葉兩葉核;約41.9％的細(xì)胞胞內(nèi)含有紫紅色的異染顆粒;免疫熒光染色可見(jiàn)此類(lèi)細(xì)胞，胞內(nèi)顆粒表達(dá)2D7但不表達(dá)EPO，高表達(dá)ProMBP,而低表達(dá)MBP。③hiPSCs來(lái)源細(xì)胞向嗜堿性粒細(xì)胞誘導(dǎo)后，2D7+/EPO-的細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于hESCs(H1)來(lái)源的細(xì)胞;ProMBP陽(yáng)性率高于hESCs，而MBP陽(yáng)性率卻比hESCs低。④通過(guò)FACS分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面有嗜堿性粒細(xì)胞特異性標(biāo)志的表達(dá)，并且RT

12、-PCR的檢測(cè)也證實(shí)這些細(xì)胞不含有嗜酸性粒細(xì)胞的基因。⑤趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗜堿性粒細(xì)胞比嗜酸性粒細(xì)胞的趨化功能更強(qiáng)。⑥嗜堿性粒細(xì)胞能有效地釋放組胺，而且在液體培養(yǎng)第21天的釋放量比第14天多。
　　 [結(jié)論]通過(guò)細(xì)胞因子的三步誘導(dǎo)方法可以從hESCs成功有效地誘導(dǎo)得到一定比例的成熟的嗜堿性粒細(xì)胞，并且在hiPSCs的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。此嗜堿性粒細(xì)胞具有其特有的趨化功能，并且經(jīng)FcεRⅠ刺激能釋放組胺。本研究證實(shí)了該誘導(dǎo)方法可靠