應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞(ESCs)裂解液逆轉(zhuǎn)化胎兒成纖維細(xì)胞(MEFs)為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)的研究.pdf

1、誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞發(fā)生去分化并形成類似于ESCs多能性細(xì)胞特征的過(guò)程稱作“體細(xì)胞重編程”。從ESCs裂解液中提取活性物質(zhì)誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的過(guò)程，既沒(méi)有誘導(dǎo)性干細(xì)胞基因組染色質(zhì)的直接參與，也沒(méi)有被誘導(dǎo)體細(xì)胞基因組DNA結(jié)構(gòu)序列的變化;研究ESCs提取物中有活性細(xì)胞因子的作用，有利于發(fā)現(xiàn)和識(shí)別與重編程相關(guān)的細(xì)胞因子及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)而研究其相互作用關(guān)系;因?yàn)镋SCs的提取物直接誘導(dǎo)靶細(xì)胞使其發(fā)生了生物學(xué)變化，而沒(méi)有引起靶

2、細(xì)胞基因組堿基序列發(fā)生結(jié)構(gòu)學(xué)變化，不會(huì)使靶細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)變異，因此，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)體細(xì)胞重編程所誘導(dǎo)形成的多能干細(xì)胞具有更好的生物安全性;以上種種優(yōu)勢(shì)賦予這項(xiàng)研究?jī)?nèi)容在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究通過(guò)優(yōu)化小鼠體內(nèi)受精囊胚、雜合二倍體孤雌囊胚、人工重組異期卵母細(xì)胞核二倍體孤雌囊胚（含有速激核成熟新生鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞與成熟卵母細(xì)胞基因組二倍體小鼠孤雌囊胚）的獲取途徑，獲得不同囊胚來(lái)源的ESCs。采

3、用形態(tài)學(xué)觀察法、堿性磷酸酶(AKP)染色法、核型分析法、Oct-4和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)法、Oct-4基因和Sox-2基因表達(dá)檢測(cè)法、類胚體(EB)分化能力檢測(cè)等方法對(duì)其ESCs的特性進(jìn)行鑒定。用于被誘導(dǎo)的受體MEFs，采用曲古抑菌素A(TSA)和5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-dc)預(yù)處理，然后再經(jīng)過(guò)適宜濃度鏈球菌溶血素O(SLO)滲透化處理;用于起誘導(dǎo)作用的不同囊胚來(lái)源的小鼠ESCs，采用液氮反復(fù)凍融和離心的方法，得到

4、不同類型ESCs的無(wú)細(xì)胞裂解液;將受體細(xì)胞孵育在無(wú)細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中進(jìn)行重編程逆轉(zhuǎn)化性誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得來(lái)源于體細(xì)胞的多能干細(xì)胞。對(duì)誘導(dǎo)所得多能干細(xì)胞進(jìn)行多能干細(xì)胞特性的鑒定。借助雙重PCR性別鑒定的方法，分選出來(lái)源于雌性的有性生殖ESCs，孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)和重構(gòu)pESCs，三種雌性胚胎干細(xì)胞分別通過(guò)凍融和離心的方法，獲得三種不同類型雌性ESCs（供體細(xì)胞）的無(wú)細(xì)胞裂解液，將此作為誘導(dǎo)劑重編程逆轉(zhuǎn)化雄性MEFs（受體細(xì)胞），獲

5、得多能干細(xì)胞后，依據(jù)供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的性別差異，采用雙重PCR性別鑒定的方法確定重編程所得多能干細(xì)胞集落的來(lái)源。最后以雞成纖維細(xì)胞作為重編程的受體細(xì)胞，探討小鼠ESCs裂解液進(jìn)行種間體細(xì)胞重編程、逆轉(zhuǎn)化雞胚成纖維細(xì)胞形成多能干細(xì)胞的可行性，并通過(guò)核型分析鑒定其所得多能干細(xì)胞的來(lái)源。
　　 通過(guò)上述研究，旨在比較不同來(lái)源ESCs裂解液介導(dǎo)體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的可能性及其效率，篩選適宜的共孵育方式，驗(yàn)證重編程體系的可靠性

6、，比較有性生殖ESCs和無(wú)性生殖pESCs裂解液的作用效果，進(jìn)一步研究父本基因缺失情況下對(duì)體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)化效率的作用和對(duì)異種動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)形成多能干細(xì)胞的可能性。這項(xiàng)研究結(jié)果將為今后進(jìn)一步探索ESCs和pESCs裂解液中重編程有效成分的篩選、鑒定和物種間多能干細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　 1.用于分離小鼠ESCs的三種囊胚有效生成途徑研究
　　 1.1小鼠體內(nèi)受精囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)集落獲取的條件優(yōu)化

7、r>　　 本研究首先通過(guò)比較不同胎齡MEFs的生長(zhǎng)狀況和連續(xù)傳代過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，研究影響MEFs分離和培養(yǎng)效率的因素，旨在為早期胚胎共培養(yǎng)體系選擇更加有效的MEFs的分離培養(yǎng)體系，用于MEFs飼養(yǎng)層的制備、ESCs的分離培養(yǎng)和被誘導(dǎo)受體細(xì)胞的篩查處理。然后，采集3.5d、4d和4.5d胎齡的胚胎，分別移入DMEM培養(yǎng)液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)培養(yǎng)液和包含有MEFs貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)，比較三種培養(yǎng)體

8、系中ICM孵出的時(shí)間、孵化囊胚貼壁比率和ICM集落形成比率，旨在篩選獲取優(yōu)質(zhì)ICM集落的實(shí)驗(yàn)方法，為ESCs的分離培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:采用12.5-14.5d胎齡的小鼠胎兒分離MEFs，傳代培養(yǎng)后選取第3代MEFs制備飼養(yǎng)層，采集4d的小鼠囊胚置于其MEFs飼養(yǎng)層的共培養(yǎng)體系中，經(jīng)體外培養(yǎng)3-4d，可以獲取優(yōu)質(zhì)的ICM，這為體內(nèi)受精囊胚來(lái)源ESCs的分離培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.2小鼠雜合二倍體孤雌囊胚生成途徑的優(yōu)化

9、>　　 本研究采用5種化學(xué)激活方法即乙醇、乙醇+6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、乙醇+6-DMAP+細(xì)胞松弛素B(CB)、SrCl2、SrCl2+CB處理小鼠成熟卵母細(xì)胞，通過(guò)觀察激活卵母細(xì)胞第二極體排出情況和核型分析，探討不同激活方法所得激活卵母細(xì)胞染色體倍性的傾向類型，比較不同染色體倍性激活卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力，篩選有利于形成雜合二倍體孤雌囊胚的激活方法。結(jié)果表明:在含有10％乙醇培養(yǎng)液中激活卵母細(xì)胞5min的基礎(chǔ)上，添加6

10、-DMAP有利于抑制第二極體的排出，促進(jìn)雙原核(2PN)雜合二倍體孤雌胚胎的形成，獲取更高的過(guò)二細(xì)胞阻滯率和桑葚胚/囊胚發(fā)育率;采用含有10mMSrCl2和5μg/mLCB處理卵母細(xì)胞4h，也能夠獲取較多的雙原核(2PN)雜合二倍體和較高的桑葚胚/囊胚發(fā)育率，因此，以上兩種孤雌激活方法適宜用于獲取小鼠雜合二倍體孤雌囊胚。
　　 1.3人工重組異期卵母細(xì)胞核二倍體孤雌囊胚（含有速激核成熟新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞和MⅡ期卵母細(xì)胞基因

11、組的二倍體孤雌胚胎）的構(gòu)建
　　 本研究分別研究了CB對(duì)生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞去核效果的影響、去除成年小鼠MI期卵母細(xì)胞GV的方法選擇、新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞與去核GV期卵母細(xì)胞黏合體系的篩選、電融合條件選擇以及重構(gòu)胚化學(xué)激活方法的篩選等，旨在構(gòu)建含有速激核成熟新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞和MⅡ期卵母細(xì)胞基因組的二倍體孤雌胚胎，用于ESCs的分離。結(jié)果表明:預(yù)先采用10μg/mLCB溶液處理GV期卵母細(xì)胞，0.5％鏈霉蛋白酶去除

12、GV期卵母細(xì)胞的透明帶，顯微操作儀上去除生發(fā)泡，將去除生發(fā)泡的GV期卵母細(xì)胞與新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞移入自制凹窩內(nèi)進(jìn)行黏合，選擇1.5KV/cm-2.0KV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度、40μs的脈沖寬度對(duì)黏合細(xì)胞進(jìn)行電擊，發(fā)生電融合和電激活，獲得排出了第一極體的速激核成熟重構(gòu)卵母細(xì)胞。利用顯微操作儀將重構(gòu)卵母細(xì)胞的核區(qū)移植到去除第一極體的MⅡ期成熟卵母細(xì)胞的透明帶下，通過(guò)電融合使兩者發(fā)生融合，形成含有兩個(gè)MⅡ期卵母細(xì)胞核的重構(gòu)卵細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)對(duì)其

13、進(jìn)行7％乙醇(5min)聯(lián)合2.5mmol/L6-DMAP(4h)的激活后用于體外培養(yǎng)，可以構(gòu)建出含有速激核成熟新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞和MⅡ期卵母細(xì)胞基因組的二倍體孤雌胚胎。
　　 2.小鼠ESCs、pESCs和重構(gòu)pESCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 2.1小鼠體內(nèi)受精囊胚ESCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 本研究采集13.5d胎齡的胎兒分離MEFs，選取第3代MEFs制備飼養(yǎng)層;分別采用全胚法和免疫外科法從4d

14、胚齡的囊胚中獲取ICM，將ICM小團(tuán)塊移到飼養(yǎng)層上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，觀察集落形態(tài)，并對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行多能性鑒定。結(jié)果表明:采用全胚法和免疫外科法均能分離得到小鼠ESCs集落，其集落形成率差異不顯著（30.26±2.77％vs32.92±4.37％，P＞0.05）。兩種方法所得ESCs集落具有典型的ESCs形態(tài)特征，AKP染色陽(yáng)性，ESCs的染色體為二倍體，具有正常核型，Oct-4和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)表明ESC

15、s表達(dá)多能性基因:Oct-4和Sox-2，RT-PCR檢測(cè)顯示EB中三個(gè)胚層的標(biāo)記基因（Fgf-5、BraT和Afp）均為陽(yáng)性。
　　 2.2昆明小鼠孤雌囊胚來(lái)源pESCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 鑒于孤雌囊胚于體外培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，胚胎難以突破透明帶引起囊胚孵化率和貼壁率降低的情況，本研究選用免疫外科法分離單倍體pESCs（源自SrCl2激活卵母細(xì)胞4h所得囊胚）和二倍體pESCs（源自10mMSrCl2+5μg/mLCB

16、激活卵母細(xì)胞4h所得囊胚），并對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定，旨在探討孤雌囊胚染色體倍性對(duì)pESCs分離和培養(yǎng)效率的影響，篩選適宜倍性的孤雌囊胚獲取pESCs。結(jié)果表明:本研究所得到的pESCs集落具有與體內(nèi)受精囊胚來(lái)源ESCs類似的多能性鑒定效果。從二倍體孤雌囊胚分離所得pESCs的集落形成率顯著高于單倍體孤雌囊胚處理組（13.54±4.43％vs7.17±4.45％，P＜0.05），宜選擇有利于提高二倍體孤雌囊胚形成率的激活方法進(jìn)行pES

17、Cs的分離。
　　 2.3異期二倍染色體重構(gòu)胚胎來(lái)源pESCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 本研究通過(guò)構(gòu)建包含有新生小鼠生長(zhǎng)初期卵母細(xì)胞和MⅡ期卵母細(xì)胞的二倍染色體重構(gòu)核型孤雌胚胎，經(jīng)體外培養(yǎng)獲得囊胚，采用全胚法分離pESCs，并對(duì)所得重構(gòu)pESCs進(jìn)行多能性鑒定。結(jié)果表明:將融合后發(fā)育至桑葚胚期和囊胚期的180枚胚胎轉(zhuǎn)移到MEFs飼養(yǎng)層上，48h后從透明帶中孵出并貼壁于飼養(yǎng)層上，96h后ICM長(zhǎng)出并開(kāi)始增殖，5d后ICM增

18、殖成柱狀，挑出消化離散成細(xì)胞小團(tuán)塊后，5d后可見(jiàn)形成了26個(gè)pESCs集落，其集落形成率為14.43±4.36％。所得集落具有與體內(nèi)受精囊胚來(lái)源ESCs類似的多能性鑒定效果。
　　 3.應(yīng)用小鼠ESCs裂解液重編程逆轉(zhuǎn)化MEFs為多能干細(xì)胞的研究
　　 3.1不同濃度SLO對(duì)MEFs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響
　　 本試驗(yàn)采用不同濃度SLO處理MEFs，通過(guò)比較SLO處理下MEFs的細(xì)胞密度、存活率和貼壁率，并繪制適宜濃度S

19、LO處理后MEFs的生長(zhǎng)曲線，研究不同濃度SLO對(duì)MEFs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，探討SLO對(duì)體細(xì)胞的損傷是否具有劑量依賴性，以便篩選適宜濃度的SLO用于重編程體細(xì)胞的滲透化處理。結(jié)果表明:25USLO處理組的細(xì)胞密度和經(jīng)CaCl2封膜后繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁率分別與10USLO處理組之間差異不顯著(p＞0.05)，分別極顯著地高于50U和100USLO處理組(p＜0.01)。第3代MEFs經(jīng)25USLO滲透化處理后細(xì)胞仍具有正常分裂增殖的生長(zhǎng)模式

20、，說(shuō)明該濃度的SLO對(duì)MEFs的分裂增殖影響較小。因此，宜選用25USLO對(duì)重編程MEFs進(jìn)行滲透化處理。
　　 3.2昆明小鼠ESCs裂解液的制備
　　 本研究比較了兩種機(jī)械性裂解法即超聲波處理法和液氮反復(fù)凍融法對(duì)ESCs裂解液制備效果的影響，并對(duì)所得裂解液進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)和加入未經(jīng)SLO滲透化處理的MEFs后的Oct-4免疫細(xì)胞化學(xué)染色，盡可能地排除ESCs完整細(xì)胞或細(xì)胞碎片殘留等造成裂解液誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的假陽(yáng)性，

21、旨在探討適宜的ESCs裂解方法，以獲得用于體細(xì)胞重編程的高效ESCs裂解液。結(jié)果表明:液氮反復(fù)凍融7次可使ESCs細(xì)胞絕大部分發(fā)生裂解，獲得的總蛋白質(zhì)濃度顯著高于超聲波裂解細(xì)胞處理組(35.6mg/mLvs14.3mg/mL)。裂解液經(jīng)體外培養(yǎng)后未見(jiàn)MEFs飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)有ESCs集落，AKP染色也未見(jiàn)紅棕色細(xì)胞，Oct-4免疫細(xì)胞化學(xué)染色MEFs為陰性反應(yīng)。因此，宜選擇液氮反復(fù)凍融7次的方法制備用于體細(xì)胞重編程的ESCs裂解液。

22、　　 3.3小鼠ESCs裂解液與MEFs共孵育體系的研究
　　 本研究首先探討了供、受體細(xì)胞的性別屬性對(duì)ESCs裂解液誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程效率的影響，結(jié)果表明供、受體細(xì)胞性別對(duì)ESCs裂解液誘導(dǎo)MEFs重編程所得多能干細(xì)胞集落數(shù)量無(wú)顯著差異。然后，比較了三種不同來(lái)源囊胚分離所得雌性ESCs裂解液重編程雄性MEFs或經(jīng)過(guò)TSA和5-aza-dC預(yù)處理的雄性MEFs為多能干細(xì)胞的效率，以雄性MEFs與其自身裂解液共孵育和未經(jīng)裂解液處理

23、的雄性MEFs作為對(duì)照組，并對(duì)所得多能干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，旨在探討適宜的裂解液誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程體系。結(jié)果表明:體內(nèi)受精囊胚來(lái)源并經(jīng)雙重PCR性別鑒定為雌性的ESCs裂解液、孤雌囊胚ESCs裂解液和重構(gòu)囊胚來(lái)源ESCs裂解液均能夠重編程雄性MEFs為多能干細(xì)胞，這些多能干細(xì)胞集落具有與體內(nèi)受精囊胚來(lái)源ESCs類似的多能性鑒定指標(biāo)表現(xiàn)。在重編程所得多能干細(xì)胞集落數(shù)量上，體內(nèi)受精囊胚來(lái)源雌性ESCs裂解液處理組（64.33±3.7個(gè)、80.67±

24、2.08個(gè)）＞重構(gòu)囊胚來(lái)源ESCs裂解液處理組（45.00±4.36個(gè)、53.67±3.06個(gè)）＞孤雌囊胚處理組（35.67±2.52個(gè)、47.67±4.16個(gè)）;TSA和5-Aza-dC的預(yù)處理有助于促進(jìn)雄性MEFs的重編程，但是，在沒(méi)有ESCs裂解液的誘導(dǎo)作用下，僅采用TSA和5-Aza-dC預(yù)處理雄性MEFs并不能獲得多能干細(xì)胞集落;無(wú)ESCs裂解液參與的單純重編程操作過(guò)程和雄性的MEFs裂解液并不能使雄性MEFs發(fā)生重編程，因此

25、，促使雄性MEFs發(fā)生重編程的物質(zhì)來(lái)源于ESCs的裂解液。
　　 4.ESCs裂解液誘導(dǎo)MEFs重編程所得多能干細(xì)胞集落的來(lái)源鑒定
　　 采用雙重PCR性別鑒定方法對(duì)體內(nèi)受精囊胚來(lái)源經(jīng)性別鑒定為雌性ESCs裂解液、孤雌囊胚來(lái)源pESCs裂解液和重構(gòu)孤雌囊胚來(lái)源ESCs裂解液誘導(dǎo)雄性MEFs重編程所得到的多能干細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，鑒定所得多能干細(xì)胞的來(lái)源，判定細(xì)胞提取物誘導(dǎo)的重編程體系的可靠性。結(jié)果表明:體內(nèi)受精囊胚來(lái)源經(jīng)性

26、別鑒定為雌性ESCs的裂解液、孤雌囊胚來(lái)源pESCs裂解液和重構(gòu)孤雌囊胚來(lái)源的ESCs裂解液均能夠誘導(dǎo)雄性MEFs重編程為多能干細(xì)胞，所得多能干細(xì)胞的基因組DNA中具有250bp的Sry基因序列片段和339bp的ZFX基因序列片段，為雄性細(xì)胞。因此，pESCs裂解液重編程所得具有多能性特征的細(xì)胞是源自于雄性MEFs，它們所表現(xiàn)出的多能性檢測(cè)指標(biāo)的陽(yáng)性反應(yīng)并不是由于裂解液制備過(guò)程中的ESCs污染所致。
　　 5.ESCs裂解液誘導(dǎo)

27、種間體細(xì)胞重編程的可行性研究
　　 本研究以雞胚成纖維細(xì)胞作為重編程的受體細(xì)胞，采用小鼠體內(nèi)受精囊胚來(lái)源ESCs裂解液與其進(jìn)行共孵育，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，研究其對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)化效果，對(duì)所獲得干細(xì)胞集落進(jìn)行多能性檢測(cè)，旨在探討小鼠ESCs裂解液作用于異種體細(xì)胞后，使其重編程逆轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞的可行性。結(jié)果表明:與小鼠ESCs裂解液共孵育的雞胚成纖維細(xì)胞均變?yōu)閳A形細(xì)胞，未見(jiàn)梭形的貼壁細(xì)胞，形成了42.33±4.5個(gè)細(xì)胞集落。細(xì)

28、胞集落經(jīng)AKP染色和Oct-4和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色，均呈陽(yáng)性反應(yīng)。表明小鼠ESCs裂解液重編程雞胚成纖維細(xì)胞后，所獲得的細(xì)胞集落表現(xiàn)出一定的多能干細(xì)胞特性，經(jīng)核型分析表明這些細(xì)胞來(lái)源于雞胚成纖維細(xì)胞。單獨(dú)的重編程操作過(guò)程和與雞胚成纖維細(xì)胞裂解液共孵育，均無(wú)法將雞胚成纖維細(xì)胞重編程為具有ESCs多能性特征的干細(xì)胞，說(shuō)明參與重編程雞胚成纖維細(xì)胞的物質(zhì)來(lái)源于小鼠ESCs的裂解液。結(jié)果表明，ESCs裂解液誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)化為多能干

29、細(xì)胞的作用也能夠在小鼠和雞的種間發(fā)生。
　　 總結(jié)論:通過(guò)共孵育（或者共培養(yǎng)）途徑應(yīng)用ESCs的無(wú)細(xì)胞裂解液作為誘導(dǎo)劑，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)（處理后1天內(nèi)呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯著變化成為圓形細(xì)胞;4天內(nèi)形成邊界清晰的細(xì)胞集落;共孵育后第3天細(xì)胞集落表現(xiàn)AKP活性，第7天細(xì)胞表達(dá)Oct-4、Sox-2和Nanog基因）逆轉(zhuǎn)化經(jīng)過(guò)SLO、TSA和5-Aza-dC預(yù)處理的MEFs成為多能干細(xì)胞;應(yīng)用這個(gè)逆轉(zhuǎn)化體細(xì)胞成為多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)體系