Apelin促進人誘導性多能干細胞心肌定向分化的實驗研究.pdf

1、背景：
　　誘導性多能干細胞(iPSC)是通過對體細胞重編程得到的多能干細胞,具有與胚胎干細胞類似的自我更新和多向分化潛能。Taka has hi等采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別向鼠和人的成纖維細胞導入特定的轉(zhuǎn)錄因子,首次成功建立了 miPSC和hiPSC。因其具有取材容易,避免了胚胎干細胞的倫理問題,同體移植免疫排斥反應弱等諸多優(yōu)點逐漸成為心臟再生治療中備受注目的細胞來源。然而,由于iPSC具有較高的惡性增殖能力、心肌誘導分化效率低,如

2、何降低其成瘤性以及提高分化效率成為亟待解決的重要問題。Ape lin是一種調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能的活性肽,高表達于小鼠胚胎心臟發(fā)生原始部位,已被證實對胚胎干細胞的心肌定向分化具有促進作用。
　　目的：
　　本實驗采用apelin對人誘導性多能干細胞(hiPSC)進行誘導,探討其對心肌細胞定向分化的作用。
　　方法：
　　(1)利用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)制備hiPSC滋養(yǎng)層細胞;
　　(2) hiPSC的培

3、養(yǎng)與傳代;
　　(3)免疫熒光染色(IF)鑒定hiPSC干細胞全能性標志物Oct4和Nanog;
　　(4)利用懸浮法制備擬胚體（EB),對照組使用常規(guī)誘導分化培養(yǎng)基,處理組在培養(yǎng)液中加入apelin;
　　(5) qPCR檢測不同誘導時間點擬胚體干細胞全能性標志物和心臟發(fā)生過程中階段性標志物基因表達水平;
　　(6) Western blot檢測不同誘導時間擬胚體干細胞全能性標志物和心臟發(fā)生過程中階段性標志物的

4、蛋白表達水平;
　　(7) IF檢測對照組與apelin處理組間縫隙連接蛋白43(Cx43)和心肌特異性分化標志物肌鈣蛋白I(cTn I)的表達變化差異及流式細胞術(FCM)檢測兩組cTn I的陽性率;
　　(8)透射電鏡(TEM)觀察對照組與apelin處理組心肌樣細胞(hiPSC-CM)的超微結(jié)構變化。
　　結(jié)果：
　　(1) hiPSC在倒置顯微鏡下觀察呈類圓形克隆,在滋養(yǎng)層細胞背景下邊界清晰且立體感強。全

5、能性干細胞標志物Oct-4、Nanog免疫熒光染色后呈陽性;經(jīng)懸浮培養(yǎng)后形成擬胚體,隨誘導時間逐漸向周邊分化。
　　(2) qPCR的結(jié)果顯示,apelin處理組中干細胞全能性標志物Oct4和Nanog在誘導分化后第3天的表達水平下降,為同期對照組的(63.2±10.1)％和(51.7±1.6)%(p<0.01); Nkx2.5和CTn I在分化后第7天表達上調(diào),分別為同期對照組的(162.4±22.5)%和(250.6±22.3

6、)%(p<0.05,p<0.01)說明ape lin可促進擬胚體向心臟譜系細胞分化,提高擬胚體心臟發(fā)生過程中階段性特異性標志物基因表達的水平;
　　(3) Western blot檢測顯示,apelin處理組在Nanog的表達隨apelin處理天數(shù)的延長而逐漸降低,于第15天下降最為明顯,Mef2c、c Tn T在第7天表達增強,第15天cTn I表達明顯增加;
　　(4) IF檢測結(jié)果顯示,兩組均有Cx43、cTn I表達

7、,但apelin處理組的陽性細胞數(shù)量明顯增多。
　　(5) FCM鑒定結(jié)果顯示,對照組與 apelin處理組 cTn I的陽性率分別為(9.3±5.2)%和(52.2±6.7)%,有顯著性差異(p<0.05);
　　(6) TEM結(jié)果顯示,對照組胞內(nèi)有線粒體的出現(xiàn),但內(nèi)外膜不清晰;ape lin處理組出現(xiàn)排列規(guī)則的肌纖維,胞內(nèi)出現(xiàn)成熟的線粒體。
　　結(jié)論：
　　Ape lin可促進hiPSC分化產(chǎn)物的心肌分化標志