HIF-1α在缺氧-復(fù)氧性HK-2細(xì)胞損傷中作用及丹參干預(yù)研究.pdf

1、背景和目的：缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是1992年Semenza對經(jīng)缺氧處理的Hep3B和HepG2細(xì)胞株的核提取物進(jìn)行電泳位移分析時首先被發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，能與靶基因結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使機(jī)體對缺氧、缺血產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1的發(fā)現(xiàn)使人們對缺氧缺血狀態(tài)下機(jī)體各種應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制的研究更加深入。近幾年，HIF-1在腎臟中的作用也逐漸受到人

2、們的關(guān)注。 腎臟對于缺氧是非常敏感的。腎臟缺氧缺血性損傷是圍產(chǎn)期窒息、肺炎、腎臟移植和腎臟手術(shù)等臨床共同面臨的問題。在缺氧、缺血狀態(tài)下可誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)的增加，HIF-1能啟動下游基因表達(dá)上調(diào)，在促進(jìn)糖酵解，有效利用氧，紅細(xì)胞增生及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體增加等方面，HIF-1參與了缺氧細(xì)胞的能量代謝及氧利用障礙發(fā)生機(jī)制，對腎臟細(xì)胞具有明確的保護(hù)效應(yīng)。 腎小管上皮細(xì)胞及其腎小管周圍成纖維細(xì)胞不僅是構(gòu)成腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞，還是

3、腎臟病變的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。由于腎損傷最早的部位即腎小管，腎小管上皮細(xì)胞不僅是缺氧/復(fù)氧時的靶細(xì)胞，還是造成損傷進(jìn)展的主要參與者。本文在前期建立人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)缺氧/復(fù)氧的損傷模型基礎(chǔ)上，探討HIF-1α在腎臟缺氧/復(fù)氧性損傷中的表達(dá)規(guī)律，探討其表達(dá)的意義。 眾多實驗研究表明：中藥能較好地抗缺氧/復(fù)氧的損傷，具有良好的應(yīng)用前景。其中，丹參是尤為受到廣泛關(guān)注的中藥。已有研究表明，丹參對缺氧/復(fù)氧性損傷具有顯著的保護(hù)作

4、用。我們在前期建立人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)缺氧/復(fù)氧的損傷模型基礎(chǔ)上，研究丹參對缺氧/復(fù)氧損傷的HK-2細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的影響，來探討丹參的保護(hù)作用與HIF-1α表達(dá)之間的關(guān)系。 方法： (1)以人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對象； (2)采用液體石蠟覆蓋法建立缺氧/復(fù)氧模型，其中丹參組在覆蓋石蠟的同時加入丹參注射液，丹參注射液(生藥濃度為1ml含丹參1g)終濃度選為已證實為最佳有效濃度0.

5、1％。 (3)實驗分為三個組：第一大組為正常對照組；第二大組為模型組；第三大組為丹參組。每組都包括H1h、H4h、H8h、H12h、H24h、H/R1h、H/R4h、H/R8h、H/R12h、H/R24h。 (4)檢測指標(biāo)：用ABC酶染色免疫組化法測定HIF-1α的陽性率(％)，MTT法進(jìn)行活細(xì)胞的計數(shù)，生化法檢測培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性； (5)統(tǒng)計學(xué)處

6、理：所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，實驗組各時間點(diǎn)進(jìn)行單因素方差分析，組間進(jìn)行LSD檢驗。P<0.05為差異有顯著性。采用SPSS11.5軟件完成。 結(jié)果： (1)經(jīng)免疫組化檢測，HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞核。在三個實驗組之間均有顯著差異(P<0.05)。在對照組，HIF-1α有陽性表達(dá)，但陽性率低，在10.81±0.89％±17.67±1.99％之間(>5％)。對照組與模型組之間比較，差異有顯著性(P<0.05

7、)。在缺氧第1小時后，HIF-1α即有明顯增高，達(dá)37.78±1.07％，隨著缺氧時間的增加，陽性率也不斷升高，在缺氧24小時達(dá)最高峰(73.26±1.89％)，復(fù)氧后HIF-1α的表達(dá)仍在升高，直到復(fù)氧4小時達(dá)最高峰，陽性率為87.68±1.38％，隨后逐漸下降，在復(fù)氧后24小時達(dá)最低水平；組間各時間點(diǎn)差異具有顯著性(P<0.05)。與模型組相比，在丹參組，各個時間點(diǎn)的HIF-1α表達(dá)陽性率明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。

8、 (2)在三個實驗組之間及模型組和丹參組的各個時間點(diǎn)之間活細(xì)胞數(shù)量均有顯著差異(P<0.05)。與對照組比較，模型組活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性，(P<0.05)；并隨著缺氧時間的延長進(jìn)一步降低，在缺氧24小時到達(dá)最低值。與模型組相比，丹參組活細(xì)胞數(shù)除在H1,H8,H24改變不明顯外，其余各時間點(diǎn)明顯增多，差異具有顯著性(P<0.05)。 (3)與對照組相比，模型組LDH活性升高(P<0.05)，并隨著缺氧時間的延長而

9、逐漸增高，最高值在缺氧24小時-復(fù)氧4小時，達(dá)(44.76±3.08)IU/L和(48.85±0.32)IU/L；與模型組相比，丹參組LDH活性下降，差異具有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： (1)在腎臟HK-2細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧性損傷中，缺氧可快速導(dǎo)致HIF-1α的表達(dá)增加，隨著缺氧的延長而上升。HIF-1α的表達(dá)增加是機(jī)體的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。 (2)丹參使HIF-1α的表達(dá)下降，作用機(jī)制可能與丹參降低氧自由基