KIM-1在腎小管上皮細胞缺氧損傷中的保護作用及HIF-1信號通路調(diào)節(jié).pdf

1、KIM-1(腎損傷分子-1，kidney injury molecule-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型跨膜蛋白，特征性表達于缺氧損傷后的腎近曲小管上皮細胞頂膜，正是這種特異性使其成為診斷腎缺血缺氧損傷的理想預(yù)警分子。但新近研究發(fā)現(xiàn)KIM-1還是一種功能分子，參與了腎損傷后的修復(fù)過程。KIM-1在去分化腎小管上皮細胞的特異性表達提示可能參與腎小管上皮細胞的去分化、增殖、遷移，促進上皮細胞連續(xù)性的重建。體外試驗已證實了KIM-1是一種獨特的磷脂酰

2、絲氨酸受體，可賦予腎小管上皮細胞吞噬功能，有利于凋亡壞死細胞的清除，減輕小管梗阻。但是，KIM-1的確切功能尚未完全闡明，也無直接證據(jù)證實KIM-1的保護功能。從分子結(jié)構(gòu)看，KIM-1作為一種跨膜蛋白其胞外擁有一個6個半胱氨酸組成的免疫球蛋白樣功能域和一個富含蘇氨酸/絲氨酸的粘蛋白域，其短的胞漿區(qū)含一個保守的酪氨酸磷酸化位點，在磷酸酶抑制劑作用下被酪氨酸磷酸化，說明KIM-1可發(fā)揮粘附功能并可能激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。體外試驗還發(fā)現(xiàn)KI

3、M-1蛋白近膜區(qū)可裂解為可溶性KIM-1，這種裂解已是MAPK信號介導(dǎo)的。而MAPK在由多種應(yīng)激刺激原或炎癥因子激活的信號通路中扮演重要角色，并介導(dǎo)細胞生理病理改變，但其在KIM-1裂解功能上的意義尚見報道。根據(jù)KIM-1的分子結(jié)構(gòu)，我們推測KIM-1在腎小管缺氧損傷中可能作為一個重要的信號分子，調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞的凋亡/存活，發(fā)揮保護腎缺氧損傷的作用。
　　明確KIM-1的功能后，研究其表達調(diào)控機制非常關(guān)鍵。從本質(zhì)上講腎小管上皮

4、細胞對缺氧的應(yīng)答是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)，而KIM-1作為缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞特異性功能基因，其表達必然受到多種應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)作為一種經(jīng)典的氧依賴性保護性核轉(zhuǎn)錄因子，在缺血缺氧應(yīng)答過程中起著重要的作用。但目前明確的HIF-1靶基因中尚無腎臟特異性表達基因。在預(yù)實驗中我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α和KIM-1在HK2細胞缺氧復(fù)氧過程密切相關(guān)，通過TFsitescan軟件輔助啟動子分析發(fā)現(xiàn)KIM-1基因啟動子區(qū)含

5、有應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的結(jié)合位點。我們推測KIM-1在缺氧引起的腎小管上皮細胞損傷中受HIF-1信號通路調(diào)節(jié)，并作為HIF-1的下游靶基因參與腎損傷及修復(fù)過程。
　　本項目以人近端小管上皮細胞(HK2)為對象研究KIM-1這一新的腎臟特異性功能分子在腎小管上皮細胞缺氧損傷中的保護作用及KIM-1胞外功能區(qū)裂解在KIM-1抗缺氧損傷中的機制和可能的抗凋亡信號通路。研究KIM-1表達與經(jīng)典的氧依賴性保護性核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的關(guān)

6、系，闡明HIF-1對KIM-1的調(diào)控機制，為以KIM-1為特異性靶點的腎功能衰竭的治療提供重要試驗依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　第一部分KIM-1在腎小管上皮細胞缺氧損傷中的保護作用
　　目的：通過穩(wěn)定表達KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2細胞株的建立，觀察KIM-1對HK2細胞缺氧損傷后增殖及凋亡的影響，證實KIM-1的保護作用。
　　方法：
　　1.pcDNA-hKIM-1-HK2細胞株的建立

7、：將獲得的pcDNA-hKIM-1質(zhì)粒進行PCR鑒定，鑒定正確后擴增并轉(zhuǎn)染HK2細胞。用G418培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染的HK2細胞進行反復(fù)篩選，獲得穩(wěn)定表達KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2細胞株。再用免疫細胞化學(xué)、PCR及Western-Blot對轉(zhuǎn)染的HK2細胞鑒定，確定pcDNA-hKIM-1-HK2細胞高表達KIM-1。
　　2. KIM-1對缺氧誘導(dǎo)HK2細胞凋亡的保護效應(yīng)：觀察pcDNA-hKIM-1-HK2、HK2和

8、KIM-1抗體預(yù)處理的pcDNA-hKIM-1-HK2細胞在缺氧損傷中細胞形態(tài)、細胞活力及凋亡指標(biāo)，確定KIM-1表達對HK2細胞缺氧損傷的保護效應(yīng)。
　　結(jié)果
　　1.質(zhì)粒鑒定結(jié)果顯示在100bp左右擴增出一明亮條帶，與理論堿基對吻合，質(zhì)粒鑒定正確。免疫細胞化學(xué)鑒定提示KIM-1表達定位于細胞膜，PCR及Western-Blot提示轉(zhuǎn)染的HK2細胞高表達KIM-1。
　　2. pcDNA-hKIM-1-HK2細胞具有

9、明顯的抗缺氧損傷作用，細胞增殖活力高于對照組，細胞凋亡數(shù)量及流式細胞儀檢測的缺氧早、中、晚期凋亡指數(shù)明顯低于對照組(p＜0.01)。
　　第二部分可溶性KIM-1裂解抗腎小管上皮細胞缺氧損傷的作用機制
　　目的：明確KIM-1胞外功能區(qū)裂解在KIM-1抗缺氧損傷功能中的機制，探討這種裂解功能對凋亡相關(guān)信號分子的影響。
　　方法：
　　1. ELISA法檢測pcDNA-hKIM-1-HK2、缺氧及正常HK2細胞培養(yǎng)

10、基中可溶性KIM-1裂解形式含量以及KIM-1抗體對可溶性KIM-1表達的影響，觀察KIM-1的胞外功能區(qū)裂解功能。
　　2.使用p38MAPK抑制劑SB203580阻斷KIM-1裂解功能后觀察pcDNA-hKIM-1-HK2細胞在缺氧損傷中細胞形態(tài)、細胞活力及凋亡指標(biāo)，確定KIM-1胞外功能區(qū)裂解是KIM-1保護細胞缺氧損傷的機制。
　　3. Western-blot檢測不同劑量p38MAPK抑制劑預(yù)處理后的pcDNA-h

11、KIM-1-HK2細胞缺氧時ERK、p38MAPK、JNK、AKT的變化，明確KIM-1胞外功能區(qū)裂解對抗細胞損傷可能的抗凋亡信號機制。
　　結(jié)果
　　1. pcDNA-hKIM-1-HK2和缺氧的HK2細胞膜高表達KIM-1，在細胞培養(yǎng)基中檢測到可溶性KIM-1存在，說明膜型KIM-1可通過胞外功能區(qū)的裂解功能向培養(yǎng)基中釋放可溶性裂解形式。
　　2. p38MAPK抑制劑SB203580可抑制KIM-1的裂解功能，并

12、抑制KIM-1介導(dǎo)的抗缺氧損傷作用。p38MAPK抑制劑預(yù)處理的HK2細胞增殖活力低于對照組，細胞凋亡數(shù)量及流式細胞儀檢測的缺氧早、中、晚期凋亡指數(shù)明顯高于對照組(p＜0.01)，而且這種作用呈劑量依賴性。
　　3. p38MAPK抑制劑預(yù)處理的HK2細胞缺氧損傷時，ERK、AKT的表達量無明顯變化，但磷酸化的ERK、AKT顯著降低，P38，JNK的磷酸化也有所降低，但其變化沒有ERK和AKT顯著?？扇苄訩IM-1可能通過PI3K

13、-AKt/PKB通路和ERK通路來抑制細胞凋亡。
　　第三部分KIM-1在腎小管上皮細胞缺氧損傷中表達的HIF-1信號通路調(diào)節(jié)
　　目的：觀察HK2細胞缺氧損傷過程中KIM-1和HIF-1α表達的相關(guān)性及HIF-1α表達對KIM-1表達的影響。通過ChIP和EMSA驗證HIF-1與KIM-1基因啟動子區(qū)結(jié)合情況，證實KIM-1的表達受HIF-1信號通路調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　1. Real Time RT-PCR

14、和Western-blot檢測HK2細胞缺氧復(fù)氧不同時段KIM-1、HIF-1αmRNA和蛋白水平表達，免疫熒光雙標(biāo)染色法在激光共聚焦顯微鏡下觀察KIM-1和HIF-1α在HK2細胞的表達定位，確定KIM-1與HIF-1α表達相關(guān)性。
　　2. HIF-1α激動劑CoCl2和抑制劑Rapamycin預(yù)處理HK2細胞，觀察上調(diào)或下調(diào)HIF-1表達對KIM-1 mRNA和蛋白水平的影響，確定HIF-1對KIM-1的調(diào)節(jié)作用。
　

15、　3. KIM-1啟動子與HIF-1α結(jié)合位點的檢測：將缺氧的HK2細胞染色質(zhì)-HIFα蛋白通過ChIP試劑盒免疫共沉淀。根據(jù)預(yù)測的KIM-1啟動子區(qū)與HIF-1α結(jié)合位點的序列設(shè)計引物，用Real Time RT-PCR檢測結(jié)合位點的存在。
　　4. KIM-1啟動子與HIF-1α結(jié)合能力檢測：以KIM-1啟動子區(qū)的HRE位點為模板，設(shè)計3’端Biotin標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸探針，用EMSA檢測HK2細胞缺氧損傷不同時段探針與HI

16、F-1α的結(jié)合動力變化。同時觀察用CoCl2和Rapamycin上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達對這種結(jié)合動力的影響。
　　結(jié)果:
　　1. HK2細胞缺氧過程中KIM-1和HIF-1α蛋白和基因水平表達同步升高，在復(fù)氧過程中同步下降，說明KIM-1和HIF-1α的表達密切相關(guān)。免疫細胞化學(xué)提示KIM-1和HIF-1α共表達于缺氧的HK2細胞，KIM-1表達于細胞膜，HIF-1α表達于細胞核。
　　2. CoCl2和Rapa

17、mycin可上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達，并因此促進或抑制KIM-1的表達(p＜0.01)，而且這種調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴性。
　　3. HK2細胞缺氧后以KIM-1啟動子的HIF-1α結(jié)合位點設(shè)計引物擴增的片段出現(xiàn)在227bp，與預(yù)計符合。而未缺氧的HK2細胞未檢測出KIM-1啟動子與HIF-1α的結(jié)合位點。說明KIM-1啟動子區(qū)含有與HIF-1α結(jié)合的位點，這種結(jié)合是以缺氧為條件的。
　　4.以KIM-1啟動子區(qū)HRE位點為模

18、板設(shè)計的雙鏈寡核苷酸探針在HK2細胞缺氧損傷過程中與HIF-1α結(jié)合，上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達可分別促進或抑制這種結(jié)合能力。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，本研究用體外實驗證實了KIM-1對缺氧誘導(dǎo)HK2細胞損傷的保護效應(yīng)，這種保護效應(yīng)通過p38-MAPK途徑對KIM-1胞外功能區(qū)的裂解，從而激活下游PI3K-AKt/PKB和ERK通路，促進AKT、ERK的磷酸化，實現(xiàn)促進細胞增殖及抗凋亡作用。而且KIM-1在HK2細胞缺氧損