KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用及HIF-1信號(hào)通路調(diào)節(jié).pdf

1、KIM-1(腎損傷分子-1，kidney injury molecule-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型跨膜蛋白，特征性表達(dá)于缺氧損傷后的腎近曲小管上皮細(xì)胞頂膜，正是這種特異性使其成為診斷腎缺血缺氧損傷的理想預(yù)警分子。但新近研究發(fā)現(xiàn)KIM-1還是一種功能分子，參與了腎損傷后的修復(fù)過(guò)程。KIM-1在去分化腎小管上皮細(xì)胞的特異性表達(dá)提示可能參與腎小管上皮細(xì)胞的去分化、增殖、遷移，促進(jìn)上皮細(xì)胞連續(xù)性的重建。體外試驗(yàn)已證實(shí)了KIM-1是一種獨(dú)特的磷脂酰

2、絲氨酸受體，可賦予腎小管上皮細(xì)胞吞噬功能，有利于凋亡壞死細(xì)胞的清除，減輕小管梗阻。但是，KIM-1的確切功能尚未完全闡明，也無(wú)直接證據(jù)證實(shí)KIM-1的保護(hù)功能。從分子結(jié)構(gòu)看，KIM-1作為一種跨膜蛋白其胞外擁有一個(gè)6個(gè)半胱氨酸組成的免疫球蛋白樣功能域和一個(gè)富含蘇氨酸/絲氨酸的粘蛋白域，其短的胞漿區(qū)含一個(gè)保守的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，在磷酸酶抑制劑作用下被酪氨酸磷酸化，說(shuō)明KIM-1可發(fā)揮粘附功能并可能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。體外試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)KI

3、M-1蛋白近膜區(qū)可裂解為可溶性KIM-1，這種裂解已是MAPK信號(hào)介導(dǎo)的。而MAPK在由多種應(yīng)激刺激原或炎癥因子激活的信號(hào)通路中扮演重要角色，并介導(dǎo)細(xì)胞生理病理改變，但其在KIM-1裂解功能上的意義尚見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)KIM-1的分子結(jié)構(gòu)，我們推測(cè)KIM-1在腎小管缺氧損傷中可能作為一個(gè)重要的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡/存活，發(fā)揮保護(hù)腎缺氧損傷的作用。
　　明確KIM-1的功能后，研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制非常關(guān)鍵。從本質(zhì)上講腎小管上皮

4、細(xì)胞對(duì)缺氧的應(yīng)答是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)，而KIM-1作為缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞特異性功能基因，其表達(dá)必然受到多種應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)作為一種經(jīng)典的氧依賴(lài)性保護(hù)性核轉(zhuǎn)錄因子，在缺血缺氧應(yīng)答過(guò)程中起著重要的作用。但目前明確的HIF-1靶基因中尚無(wú)腎臟特異性表達(dá)基因。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α和KIM-1在HK2細(xì)胞缺氧復(fù)氧過(guò)程密切相關(guān)，通過(guò)TFsitescan軟件輔助啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)KIM-1基因啟動(dòng)子區(qū)含

5、有應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)。我們推測(cè)KIM-1在缺氧引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷中受HIF-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并作為HIF-1的下游靶基因參與腎損傷及修復(fù)過(guò)程。
　　本項(xiàng)目以人近端小管上皮細(xì)胞(HK2)為對(duì)象研究KIM-1這一新的腎臟特異性功能分子在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用及KIM-1胞外功能區(qū)裂解在KIM-1抗缺氧損傷中的機(jī)制和可能的抗凋亡信號(hào)通路。研究KIM-1表達(dá)與經(jīng)典的氧依賴(lài)性保護(hù)性核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的關(guān)

6、系，闡明HIF-1對(duì)KIM-1的調(diào)控機(jī)制，為以KIM-1為特異性靶點(diǎn)的腎功能衰竭的治療提供重要試驗(yàn)依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　第一部分KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中的保護(hù)作用
　　目的：通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株的建立，觀察KIM-1對(duì)HK2細(xì)胞缺氧損傷后增殖及凋亡的影響，證實(shí)KIM-1的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株的建立

7、：將獲得的pcDNA-hKIM-1質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確后擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞。用G418培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染的HK2細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞株。再用免疫細(xì)胞化學(xué)、PCR及Western-Blot對(duì)轉(zhuǎn)染的HK2細(xì)胞鑒定，確定pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞高表達(dá)KIM-1。
　　2. KIM-1對(duì)缺氧誘導(dǎo)HK2細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)：觀察pcDNA-hKIM-1-HK2、HK2和

8、KIM-1抗體預(yù)處理的pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞在缺氧損傷中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力及凋亡指標(biāo)，確定KIM-1表達(dá)對(duì)HK2細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)效應(yīng)。
　　結(jié)果
　　1.質(zhì)粒鑒定結(jié)果顯示在100bp左右擴(kuò)增出一明亮條帶，與理論堿基對(duì)吻合，質(zhì)粒鑒定正確。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定提示KIM-1表達(dá)定位于細(xì)胞膜，PCR及Western-Blot提示轉(zhuǎn)染的HK2細(xì)胞高表達(dá)KIM-1。
　　2. pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞具有

9、明顯的抗缺氧損傷作用，細(xì)胞增殖活力高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡數(shù)量及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的缺氧早、中、晚期凋亡指數(shù)明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)。
　　第二部分可溶性KIM-1裂解抗腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷的作用機(jī)制
　　目的：明確KIM-1胞外功能區(qū)裂解在KIM-1抗缺氧損傷功能中的機(jī)制，探討這種裂解功能對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)分子的影響。
　　方法：
　　1. ELISA法檢測(cè)pcDNA-hKIM-1-HK2、缺氧及正常HK2細(xì)胞培養(yǎng)

10、基中可溶性KIM-1裂解形式含量以及KIM-1抗體對(duì)可溶性KIM-1表達(dá)的影響，觀察KIM-1的胞外功能區(qū)裂解功能。
　　2.使用p38MAPK抑制劑SB203580阻斷KIM-1裂解功能后觀察pcDNA-hKIM-1-HK2細(xì)胞在缺氧損傷中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力及凋亡指標(biāo)，確定KIM-1胞外功能區(qū)裂解是KIM-1保護(hù)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制。
　　3. Western-blot檢測(cè)不同劑量p38MAPK抑制劑預(yù)處理后的pcDNA-h

11、KIM-1-HK2細(xì)胞缺氧時(shí)ERK、p38MAPK、JNK、AKT的變化，明確KIM-1胞外功能區(qū)裂解對(duì)抗細(xì)胞損傷可能的抗凋亡信號(hào)機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1. pcDNA-hKIM-1-HK2和缺氧的HK2細(xì)胞膜高表達(dá)KIM-1，在細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)到可溶性KIM-1存在，說(shuō)明膜型KIM-1可通過(guò)胞外功能區(qū)的裂解功能向培養(yǎng)基中釋放可溶性裂解形式。
　　2. p38MAPK抑制劑SB203580可抑制KIM-1的裂解功能，并

12、抑制KIM-1介導(dǎo)的抗缺氧損傷作用。p38MAPK抑制劑預(yù)處理的HK2細(xì)胞增殖活力低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡數(shù)量及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的缺氧早、中、晚期凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，而且這種作用呈劑量依賴(lài)性。
　　3. p38MAPK抑制劑預(yù)處理的HK2細(xì)胞缺氧損傷時(shí)，ERK、AKT的表達(dá)量無(wú)明顯變化，但磷酸化的ERK、AKT顯著降低，P38，JNK的磷酸化也有所降低，但其變化沒(méi)有ERK和AKT顯著?？扇苄訩IM-1可能通過(guò)PI3K

13、-AKt/PKB通路和ERK通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。
　　第三部分KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷中表達(dá)的HIF-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)
　　目的：觀察HK2細(xì)胞缺氧損傷過(guò)程中KIM-1和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性及HIF-1α表達(dá)對(duì)KIM-1表達(dá)的影響。通過(guò)ChIP和EMSA驗(yàn)證HIF-1與KIM-1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況，證實(shí)KIM-1的表達(dá)受HIF-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　1. Real Time RT-PCR

14、和Western-blot檢測(cè)HK2細(xì)胞缺氧復(fù)氧不同時(shí)段KIM-1、HIF-1αmRNA和蛋白水平表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)染色法在激光共聚焦顯微鏡下觀察KIM-1和HIF-1α在HK2細(xì)胞的表達(dá)定位，確定KIM-1與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性。
　　2. HIF-1α激動(dòng)劑CoCl2和抑制劑Rapamycin預(yù)處理HK2細(xì)胞，觀察上調(diào)或下調(diào)HIF-1表達(dá)對(duì)KIM-1 mRNA和蛋白水平的影響，確定HIF-1對(duì)KIM-1的調(diào)節(jié)作用。
　

15、　3. KIM-1啟動(dòng)子與HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)：將缺氧的HK2細(xì)胞染色質(zhì)-HIFα蛋白通過(guò)ChIP試劑盒免疫共沉淀。根據(jù)預(yù)測(cè)的KIM-1啟動(dòng)子區(qū)與HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物，用Real Time RT-PCR檢測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的存在。
　　4. KIM-1啟動(dòng)子與HIF-1α結(jié)合能力檢測(cè)：以KIM-1啟動(dòng)子區(qū)的HRE位點(diǎn)為模板，設(shè)計(jì)3’端Biotin標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸探針，用EMSA檢測(cè)HK2細(xì)胞缺氧損傷不同時(shí)段探針與HI

16、F-1α的結(jié)合動(dòng)力變化。同時(shí)觀察用CoCl2和Rapamycin上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達(dá)對(duì)這種結(jié)合動(dòng)力的影響。
　　結(jié)果:
　　1. HK2細(xì)胞缺氧過(guò)程中KIM-1和HIF-1α蛋白和基因水平表達(dá)同步升高，在復(fù)氧過(guò)程中同步下降，說(shuō)明KIM-1和HIF-1α的表達(dá)密切相關(guān)。免疫細(xì)胞化學(xué)提示KIM-1和HIF-1α共表達(dá)于缺氧的HK2細(xì)胞，KIM-1表達(dá)于細(xì)胞膜，HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核。
　　2. CoCl2和Rapa

17、mycin可上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達(dá)，并因此促進(jìn)或抑制KIM-1的表達(dá)(p＜0.01)，而且這種調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴(lài)性。
　　3. HK2細(xì)胞缺氧后以KIM-1啟動(dòng)子的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的片段出現(xiàn)在227bp，與預(yù)計(jì)符合。而未缺氧的HK2細(xì)胞未檢測(cè)出KIM-1啟動(dòng)子與HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)。說(shuō)明KIM-1啟動(dòng)子區(qū)含有與HIF-1α結(jié)合的位點(diǎn)，這種結(jié)合是以缺氧為條件的。
　　4.以KIM-1啟動(dòng)子區(qū)HRE位點(diǎn)為模

18、板設(shè)計(jì)的雙鏈寡核苷酸探針在HK2細(xì)胞缺氧損傷過(guò)程中與HIF-1α結(jié)合，上調(diào)或下調(diào)HIF-1α表達(dá)可分別促進(jìn)或抑制這種結(jié)合能力。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，本研究用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了KIM-1對(duì)缺氧誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，這種保護(hù)效應(yīng)通過(guò)p38-MAPK途徑對(duì)KIM-1胞外功能區(qū)的裂解，從而激活下游PI3K-AKt/PKB和ERK通路，促進(jìn)AKT、ERK的磷酸化，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖及抗凋亡作用。而且KIM-1在HK2細(xì)胞缺氧損