雌激素促進BMSCs成骨分化過程中細胞骨架變化及PI3K-Akt信號通路的調(diào)控作用研究.pdf

1、正畸牙齒移動是一個骨改建的過程，因而骨的生長與代謝直接或間接地影響正畸治療效果。雌激素作為調(diào)控骨改建的重要條件之一，具有促進細胞增殖、分化，保護細胞，抑制細胞凋亡的作用。研究表明，一定濃度的雌激素可以使體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化能力增強。
　　在細胞水平上，骨組織對雌激素刺激的反應涉及復雜的信號傳導機制，其中細胞骨架扮演著重要角色。它主要參與細胞運動、分裂分化、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸以及跨膜信息傳遞等。PI3K/Akt途徑通過改變下

2、游分子的磷酸化狀態(tài)直接調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、生長及凋亡等功能。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞中，雌激素能夠激活PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。為探討雌激素促進大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程與細胞骨架和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的相關性，本研究采用熒光染色觀察BMSCs細胞骨架變化并用原子力顯微鏡觀察BMSCs活細胞細胞骨架的變化；通過實時定量PCR、Westernblot免疫印跡分析方法，觀察了Akt、pAkt在雌激素促BMSC

3、s成骨分化過程中的表達及變化，同時分析PI3K抑制劑對Akt、pAkt的影響及機制。旨在進一步闡明雌激素促進BMSCs成骨分化的作用機制，充實雌激素調(diào)節(jié)骨代謝的作用機理。
　　研究內(nèi)容分為三個部分：
　　實驗一、大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　目的：分離、純化培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs），并對其生物學特性進行檢測和鑒定。方法：1.運用全骨髓貼壁法和密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，用BMSCs專用培養(yǎng)

4、基接種培養(yǎng)，通過MTT法分析生長曲線，應用流式細胞儀檢測細胞的表面標志抗原，利用BMSCs成骨成脂向誘導分化等方法鑒定細胞。結(jié)果：MTT測試發(fā)現(xiàn)細胞的生長曲線呈典型的“S”型，符合骨髓基質(zhì)干細胞的生長特征；細胞表面抗原檢測顯示所培養(yǎng)的BMSCs為：CD29和CD44陽性，CD11b和CD45為陰性；經(jīng)成骨、成脂向分化誘導，獲得了茜素紅染色陽性的類成骨細胞和油紅O染色陽性的類脂肪細胞。
　　結(jié)論：所采用的細胞分離培養(yǎng)方法簡便可行，所

5、獲得的細胞其表型特征與文獻報道一致，并具有多向分化潛能，確定為BMSCs。
　　實驗二、雌激素促進BMSCs成骨分化過程早期細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化
　　目的：研究17β-雌二醇對體外培養(yǎng)大鼠BMSCs細胞形態(tài)的影響，以及這種影響與成骨分化的關系。方法：以實驗一中獲得的大鼠BMSCs為研究對象，設立陰性對照組（只加DMEM培養(yǎng)液）、陽性對照組（加入DMEM和成骨誘導液）和雌激素處理組（10-6mol/L17β-雌二醇）。分別采用

6、免疫熒光染色法觀察BMSCs細胞骨架的變化以及用原子力顯微鏡觀察BMSCs活細胞細胞表面形態(tài)的變化。結(jié)果：BMSCs經(jīng)10-6mol/L17β-雌二醇處理后，實驗組BMSCs細胞骨架清晰，F(xiàn)-actin熒光顯著增強，高于陽性對照組和陰性對照組。經(jīng)定量分析，計算細胞骨架灰度值，也證實實驗組細胞骨架熒光強度高于兩個對照組，且有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。原子力顯微鏡觀察BMSCs活細胞，2小時后陰性對照組細胞出現(xiàn)收縮，細胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的應力纖

7、維不清晰；陽性對照組細胞骨架逐漸增粗；雌激素處理組細胞骨架結(jié)構(gòu)應力纖維變得粗大。結(jié)論：17β-雌二醇影響B(tài)MSCs內(nèi)細胞骨架結(jié)構(gòu)，增強細胞骨架熒光強度，使細胞骨架應力纖維增粗，從而促進BMSCs向成骨細胞分化。實驗三、PI3K/Akt信號通路在雌激素促進骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化中的作用研究
　　目的：本實驗旨在研究PI3K/Akt信號通路是否參與介導了雌激素促進大鼠BMSCs成骨分化的過程。方法：1、RT-PCR檢測各組在不同處理時

8、間下Akt、I型膠原、Runx2、OPN的表達。2、RT-PCR檢測各組在不同雌激素處理濃度下Akt、I型膠原、Runx2的表達。3、Western-blot檢測各組Akt和pAkt蛋白的表達。結(jié)果：1、雌激素可促進AktmRNA的表達，且與I型膠原出現(xiàn)的時間一致，都在成骨分化早期出現(xiàn)。2、不同濃度雌激素促進AktmRNA上調(diào)的影響有差異，10-8mol/L17β-雌二醇處理組Akt基因表達量高于其他組。且PI3K抑制劑能顯著抑制Akt