MAPKs信號通路在LPS調(diào)控的人根尖乳頭細胞成牙本質(zhì)-成骨向分化過程中的作用.pdf

1、目的：
　　細菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是誘發(fā)根尖周炎的強烈毒力因子。在壞死牙髓組織中可以檢測到LPS，細菌產(chǎn)生的LPS具有很強的滲透性，容易經(jīng)過根尖孔滲透進入根尖周組織從而導致根尖周發(fā)生病變。在年輕恒牙中，因畸形、齲壞、外傷等因素導致的牙髓根尖周病變，細菌及其內(nèi)毒素LPS會接觸刺激根尖乳頭組織中的人根尖乳頭細胞(human dental apical papillacells,HAPCs)，該

2、細胞生物學行為不可避免地受到炎性因子LPS的影響。本研究意在探究LPS對人根尖乳頭細胞增殖及分化的影響及MAPKs信號通路在LPS調(diào)控的人根尖乳頭細胞分化過程中的作用。
　　方法與結(jié)果：
　　第一部分:人根尖乳頭細胞分離培養(yǎng)及誘導礦化
　　酶消化法分離培養(yǎng)人根尖乳頭細胞，細胞的增殖能力強，生長曲線呈S形。礦化誘導21d，同對照組相比，礦化誘導組茜素紅染色呈紅褐色，鏡下見礦化結(jié)節(jié)多且深染。
　　第二部分:LPS對人

3、根尖乳頭細胞增殖及成牙本質(zhì)/成骨向分化的影響
　　采用不同濃度的LPS作用于人根尖乳頭細胞，分別應用MTT法和堿性磷酸酶試劑盒檢測LPS對人根尖乳頭細胞增殖及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的影響;結(jié)果顯示低濃度的LPS對細胞增殖及ALP活性均有促進作用。進一步用低濃度LPS作用于細胞，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，real-time PCR檢測礦化相關(guān)標記物牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentinsialop

4、hosphoprotein，DSPP)、成骨相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(runt-relatedtranscription factor2，Runx2)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)基因水平的表達。結(jié)果顯示LPS作用于細胞7d后礦化結(jié)節(jié)的形成與對照組相比無差異;礦化相關(guān)標記物DSPP、BSP、Runx2的表達上調(diào)且差異具有統(tǒng)計學意義，OCN表達未上調(diào)。14d后LPS刺激組礦化結(jié)節(jié)形

5、成增多，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義;礦化相關(guān)標記物DSPP，RUNX2、BSP、OCN均有升高，其中DSPP、RUNX2、BSP與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。21d后LPS刺激組礦化結(jié)節(jié)的形成與對照組無差異;礦化相關(guān)標記物Runx2的表達上調(diào)且差異具有統(tǒng)計學意義，DSPP、BSP、OCN表達未上調(diào)。以上結(jié)果提示，低濃度的LPS很可能在人根尖乳頭細胞成牙本質(zhì)/成骨向分化過程中起正向調(diào)控作用。第三部分:MAPKs信號通路在LPS調(diào)控人

6、根尖乳頭細胞成牙本質(zhì)/成骨向分化過程中的作用
　　應用Western Blot檢測LPS作用于人根尖乳頭細胞后MAPKs信號通路蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示，LPS促進ERK和p38的磷酸化，表明LPS可以激活ERK和p38MAPK信號通路。ERK通路抑制劑U0126/p38MAPK通路抑制劑SB203580和LPS聯(lián)合作用于細胞后，通過real-time PCR和Western Blot分別檢測礦化相關(guān)因子DSPP、Runx2

7、、BSP基因及蛋白水平的表達。利用堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP的活性。結(jié)果顯示，抑制ERK和p38MAPK信號通路后，人根尖乳頭細胞的ALP活性降低;DSPP、Runx2、BSP基因及蛋白水平的表達量均有所降低且差異具有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明抑制ERK和p38MAPK信號通路可降低LPS調(diào)控的人根尖乳頭細胞成牙本質(zhì)/成骨向分化。
　　結(jié)論：
　　低濃度的LPS可促進人根尖乳頭細胞的增殖及牙本質(zhì)/成骨向分化;同時LPS能夠激活