廣西三黃雞抗馬立克氏病相關(guān)分子遺傳學(xué)標(biāo)記的篩選研究.pdf

1、馬立克氏病(MD)是雞的一種惡性T淋巴細(xì)胞增生性疾病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大。開(kāi)展廣西三黃雞抗MD相關(guān)分子遺傳學(xué)標(biāo)記的篩選研究，旨在確立相應(yīng)的分子遺傳學(xué)標(biāo)記來(lái)促進(jìn)三黃雞的抗MD育種工作，以彌補(bǔ)目前依賴(lài)疫苗免疫和生物安全為主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下主要工作： 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析的方法，對(duì)120份霞煙雞B-LBⅡ基因第2外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用限制性?xún)?nèi)切酶Alu I、Cai I

2、、Cfr I、Hinl I、Hinf I和Rsa I分別進(jìn)行分析。運(yùn)用在這6個(gè)位點(diǎn)所觀(guān)測(cè)的純合基因型組合對(duì)R-LB Ⅱ等位基因純合型雞只進(jìn)行初步篩選，并通過(guò)進(jìn)一步的克隆、測(cè)序，最終獲得R-LBⅡ等位基因純合型雞只7羽(其中MD抗性個(gè)體5羽，代號(hào)分別為：A<,11>、C<,23>、D<,8>、D<,12>、 K<,8>；易感個(gè)體2羽，代號(hào)分別為：A<,5>、B<,21>)。所獲得7羽霞煙雞的序列經(jīng)與GenBank下載的B<'2>、B<'6

3、>、B<'12>、B<'19>、B<'21>單倍型B-LBⅡ基因的序列相比較，發(fā)現(xiàn)此基因區(qū)域堿基替代非常頻繁，呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。MD抗性個(gè)體A<,11>、C<,23>、D<,12>、K8間的核苷酸同源性達(dá)100％，與B<'6>單倍型(中等MD抗性型)核苷酸和氨基酸同源性較高，分別達(dá)到98.9％和97.8％；這4羽霞煙雞在MDV攻毒實(shí)驗(yàn)中均具有明顯的MD抗性。MD易感個(gè)體A<,5>、B<,21>間的核甘酸同源性達(dá)95.5％，與B<,19

4、>單倍型(MD易感型)核苷酸同源性分別達(dá)96.3％和94.8％，氨基酸同源性分別達(dá)91.0％和89.9％；這2羽霞煙雞在MDV攻毒實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出易感性。MD抗性個(gè)體A<,11>、C<,23>、D<,12>、K<,8>與易感個(gè)體A<,5>、B<,21>的核苷酸同源性?xún)H分別為91.4％和93-3％，氨基酸同源性?xún)H分別為83.1％和85.4％，存在較大的差異。因此，推測(cè)MD抗性個(gè)體A<,11>、C<,23>、D<,12>、K<,8>的B-LB

5、Ⅱ基因序列為具有MD抗性的一個(gè)特征序列；MD抗性個(gè)體D<,8>的B-LB Ⅱ基因序列雖與A<,11>等抗性個(gè)體的核苷酸同源性較低，但在MDV攻毒實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的MD抗性，故推測(cè)D<,8>的B-LBⅡ基因序列為具有MD抗性的另一特征序列。而MD易感個(gè)體A<,5>、B<,21>的B-LBⅡ基因序列則推測(cè)為兩個(gè)MD易感的特征序列。 應(yīng)用建立的逆轉(zhuǎn)錄酶一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)對(duì)霞煙雞GH基因轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)目的基因進(jìn)行

6、TA克隆，經(jīng)Hond Ⅲ、EcoRⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定，將目的基因片段成功定向亞克隆于pSP72質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)PCR和HindⅢ、EcoR I雙酶切鑒定，采用HindⅢ單酶切pSP72-GH重組質(zhì)粒得到線(xiàn)性化轉(zhuǎn)錄模板DNA，在體外以T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成，成功制備用于進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(RPA)的GH反義RNA探針；采用核糖核酸酶保護(hù)技術(shù)對(duì)MD抗性與易感霞煙雞個(gè)體進(jìn)行GH基因的mRNA定量表達(dá)測(cè)定，結(jié)果顯示MD

7、抗性個(gè)體的GH基因表達(dá)水平比易感個(gè)體低，且二者之間存在明顯差異，從而可以初步的把GH基因作為MY)抗性選育的分子遺傳學(xué)標(biāo)記之一。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增GH基因、B-F基因和GAPDH基因轉(zhuǎn)錄子的cDNA，并將純化的cDNA亞克隆于pGM-T載體的多克隆位點(diǎn)。重組質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR和HindⅢ、EcoR Ⅰ雙酶切鑒定及測(cè)序分析，證實(shí)GH基因、B-F基因和GAPDH基因成功重組到pGM-T載體上。將梯度濃度的

8、GH基因、B-F基因和GAPDH基因重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。經(jīng)分析顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系。動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)分析表明，在該反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的靈敏度都到達(dá)10拷貝/反應(yīng)。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GH基因、B-F基因和GAPDH基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)構(gòu)建成功。 本研究的結(jié)果表明，MD抗性雞與易感雞間的B-LBⅡ基因序列存在明顯的差異；MD