致死型約氏瘧原蟲MAP2截短蛋白免疫活性研究.pdf

1、瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播引起的一種感染性寄生原蟲疾病。在國(guó)內(nèi)外,瘧疾依然是高發(fā)的感染性寄生蟲病。由于瘧原蟲對(duì)抗瘧疾藥品耐藥性和蚊蟲對(duì)殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生及擴(kuò)散,人類與瘧疾之間的斗爭(zhēng)日趨激烈,研制安全有效的瘧疾疫苗成為控制瘧疾的重要途徑和迫切需要。
　　 根據(jù)瘧原蟲的生活史,瘧疾疫苗可分三大類:紅外期疫苗、紅內(nèi)期疫苗和傳播阻斷疫苗。雖然部分紅內(nèi)期、紅外期疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn),但目前為止,還沒有疫苗上市,在此情況下,針對(duì)瘧原蟲有性生

2、殖階段的傳播阻斷疫苗(TBVs,transmission-blocking vaccines)逐漸受到重視,成為瘧疾疫苗研究的熱點(diǎn)。TBVs通過切斷瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育的必要環(huán)節(jié),阻止瘧原蟲向未感染人群的傳播。雖然瘧疾傳播阻斷疫苗的研究取得了一定成果,但總體上,這些研究大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段,很少進(jìn)入臨床試驗(yàn)期,篩選新的、具有良好免疫原性的傳播阻斷疫苗候選抗原具有重要意義。
　　 瘧原蟲受精或其他有性生殖階段重要蛋白成分是傳播阻斷疫

3、苗研究的靶目標(biāo)。Pfmap-2(Mitogen-activated ProtonKinasc 2)是公認(rèn)的惡性瘧原蟲MAPK同源基因,其特異地在配子體階段表達(dá);研究顯示,敲除惡性瘧原蟲MAP2基因,雄配子形成完全受阻,這些特點(diǎn)提示MAP2蛋白可能具有成為傳播阻斷疫苗候選抗原的潛力。
　　 根據(jù)以上研究,本實(shí)驗(yàn)以致死型約氏瘧原蟲MAP2蛋白作為研究對(duì)象,應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)抗原的各種參數(shù)進(jìn)行分析,從中篩選出所需基因片段,有目的地進(jìn)

4、行擴(kuò)增,構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)載體,進(jìn)行動(dòng)物免疫,觀察其免疫活性,以期篩選出優(yōu)勢(shì)靶抗原,為瘧疾傳播阻斷疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、約氏瘧原蟲MAP2基因片段的獲取
　　 1、約氏瘧原蟲MAP2基因序列分析
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)手段,對(duì)致死型約氏瘧原蟲MAP2基因編碼產(chǎn)物的抗原決定簇、跨膜區(qū)域等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。
　　 2、約氏瘧原蟲基因組DNA的提取
　　 用免疫教

5、研室饋贈(zèng)的致死型約氏瘧原蟲感染野生昆明鼠,感染第三天小鼠眼球取血,按照天根生化科技有限公司的血液基因組提取試劑盒說明書,提取瘧原蟲基因組DNA。
　　 3、PCR方法從提取的基因組中擴(kuò)增MAP2基因片段
　　 4、凝膠純化PCR產(chǎn)物
　　 將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,切下瓊脂糖凝膠電泳后含目的片段的膠塊,按照天根生化科技有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。
　　 5、原核載體的構(gòu)建及

6、陽性克隆的鑒定
　　 將所得的目的片段及pGEX6p-1載體用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后分別回收所需目的片段及開環(huán)的pGEX6p-1載體,將兩者連接,命名為pGEX6p-1/MAP2。挑取平板上生長(zhǎng)的可疑陽性菌落進(jìn)行增菌,質(zhì)粒提取后用XhoⅠ或ScaⅠ單酶切鑒定。
　　 二、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/MAP2表達(dá)載體
　　 1、目的基因的獲取
　　 擴(kuò)增含有pGEX6p

7、-1/MAP2質(zhì)粒的大腸桿菌,提取質(zhì)粒做為模板,設(shè)計(jì)引物(引物含起始密碼子、終止密碼子、酶切位點(diǎn)),PCR擴(kuò)增MAP2基因。
　　 2、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段(同上)
　　 3、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及陽性克隆的鑒定
　　 將所得的目的片段及pcDNA3.1(+)載體用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后分別回收所需目的片段及開環(huán)的pcDNA3.1(+)載體,將兩者連接,命名為

8、pcDNA3.1(+)/MAP2。挑取平板上生長(zhǎng)的可疑陽性菌落進(jìn)行增菌,提取質(zhì)粒后用HindⅢ和PstⅠ雙酶切鑒定并測(cè)序。
　　 4、重組質(zhì)粒的大量制備
　　 待得到正確的測(cè)序結(jié)果后,按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒大量提取試劑盒的說明,大量提取質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,供轉(zhuǎn)染和免疫使用。
　　 三、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核細(xì)胞COS7中瞬時(shí)表達(dá)
　　 將

9、構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2轉(zhuǎn)染處于指數(shù)生長(zhǎng)期的COS7細(xì)胞,培養(yǎng)48小時(shí)后用間接免疫熒光的方法檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 四、質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)免疫活性的檢測(cè)
　　 1、動(dòng)物的免疫
　　 取4～6周齡BALB/c小鼠51只,隨機(jī)分為3組,前兩組分別在小鼠后肢股四頭肌注射質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,注射體積100μl,濃度1μg/lμl;第3組注射相同體積生理鹽水

10、。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每隔三周加強(qiáng)免疫一次,共免疫3次。
　　 2、免疫小鼠血清的收集及血清中抗體IgG的檢測(cè)
　　 在每次免疫兩周后,小鼠眼球取血,提取并保存血清。用ELISA方法檢測(cè)血清中IgG抗體及其亞類的濃度。
　　 3、免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備及細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　 在每次免疫兩周后,小鼠取脾,進(jìn)行脾細(xì)胞培養(yǎng),48小時(shí)后,用ELISA方法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10

11、的濃度。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-X±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析,0.01＜P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01表示有顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、約氏瘧原蟲MAP2基因片段的獲取
　　 1、生物信息學(xué)分析
　　 采用http://www.cbs.dtu.dk/services/

12、TMHMM/及http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic-pl在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)致死型約氏瘧原蟲MAP2基因編碼蛋白的跨膜區(qū)域、抗原決定簇等進(jìn)行預(yù)測(cè),分析顯示:390bp～1542bp處的核酸序列為胞外蛋白編碼區(qū)并且該區(qū)產(chǎn)物優(yōu)勢(shì)抗原決定簇較集中。
　　 2、PCR方法擴(kuò)增MAP2基因片段
　　 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,獲得大小約為1000bp的產(chǎn)物條帶,與預(yù)期結(jié)果(1152bp)一致。

13、
　　 3、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX6p-1/MAP2的鑒定
　　 質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ或ScaⅠ單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,前者獲得大小約為4800bp的一條帶,后者獲得兩條大小約為1700bp和3100bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 二、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2的鑒定
　　 (1)質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和PstⅠ雙單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,獲得三條帶,大小分別約為1000bp、1500bp和4000

14、bp,與預(yù)期結(jié)果(993bp、1643bp及4003bp)一致。
　　 (2)TaKaRa公司的測(cè)序結(jié)果表明,構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2包含所選取基因片段的正確序列、起始密碼子ATG、終止密碼子TAA及BamHⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)。
　　 三、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核細(xì)胞COS7中的瞬時(shí)表達(dá)
　　 間接免疫熒光顯示,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2后的細(xì)胞漿中出現(xiàn)黃綠色熒

15、光,核著藍(lán)色,而對(duì)照組即空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組僅核著藍(lán)色,胞漿并無綠色熒光。說明構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/MAP2能在真核細(xì)胞中正常表達(dá)。
　　 四、質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)免疫活性的檢測(cè)
　　 1、免疫小鼠血清IgG抗體及其亞類的檢測(cè)
　　 小鼠初次免疫后14天,實(shí)驗(yàn)組即pcDNA3.1(+)/MAP2組小鼠血清總IgG抗體水平已明顯高于空白對(duì)照組(生理鹽水組)及陰性對(duì)照組(pcDNA3.1(+)組)(P＜0

16、.01),實(shí)驗(yàn)組IgG1、IgG2a和IgG2b水平均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01),IgG1水平高于IgG2a(P＜0.5);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),總IgG抗體水平持續(xù)升高,但檢測(cè)的IgG抗體亞類升高緩慢;整個(gè)過程中,空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2、免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　 小鼠初次免疫后14天,實(shí)驗(yàn)組小鼠細(xì)胞

17、因子IL-4、IL-10水平高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P＜0.05),且IL-10水平顯著升高(P＜0.01);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),IL-4、IL-10維持在較高水平,但升高緩慢;整個(gè)過程中,空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),IFN-γ、IL-2水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了致死型約氏瘧原蟲MAP2截短蛋白