影響約氏瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)發(fā)育的因素及機(jī)制的初步研究.pdf

1、瘧疾是世界上危害最為嚴(yán)重的傳染病，該病每年感染1億多人并造成80多萬(wàn)人死亡。目前，瘧疾的防治措施主要是服用抗瘧藥物及避免或減少蚊蟲(chóng)的叮咬如使用驅(qū)避劑或浸藥蚊帳等。然而單純以藥物治療為主要策略，難以達(dá)到在全世界范圍內(nèi)消除瘧疾的目標(biāo)。因此，阻斷瘧疾傳播成為控制和消滅全球瘧疾的可靠途徑和迫切需要。阻斷瘧疾傳播的方法之一是依賴(lài)傳播阻斷疫苗(transmission?blocking vaccines，TBVs)的應(yīng)用。雖然TBVs的研制已取得階

2、段性的進(jìn)展，但是由于抗原的免疫原性弱、佐劑的應(yīng)用效果不理想及抗原不恰當(dāng)折疊等因素產(chǎn)生的影響，阻礙了瘧疾TBVs的發(fā)展，這就迫切需要一種新的阻斷傳播的策略。
　　 阻斷傳播的前提是對(duì)瘧原蟲(chóng)—蚊媒相互關(guān)系的深入認(rèn)識(shí)和了解。在按蚊-瘧原蟲(chóng)相互關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)蚊的天然免疫是其抗瘧原蟲(chóng)感染的主要機(jī)制。近期研究發(fā)現(xiàn)，采用抗生素藥物抑制蚊腸道菌群后可以導(dǎo)致岡比亞按蚊免疫反應(yīng)下調(diào)，從而促進(jìn)瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的發(fā)育；氯喹導(dǎo)致蚊絲氨酸蛋白酶、抗菌肽表達(dá)

3、下調(diào)，影響按蚊絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗菌肽轉(zhuǎn)錄水平，從而增加了按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的易感性，有利于按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的傳播。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)抗瘧藥物-硝喹能誘導(dǎo)斯氏按蚊對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)的黑化，啟動(dòng)按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，從而阻斷瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的發(fā)育，提示諸多干預(yù)因素可以調(diào)節(jié)按蚊免疫系統(tǒng)，影響瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)的發(fā)育。本課題利用大劣按蚊/約氏瘧原蟲(chóng)不易感模型和斯氏按蚊/約氏瘧原蟲(chóng)易感模型，對(duì)各種不同因素影響約氏瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)發(fā)育及其機(jī)制進(jìn)行

4、初步探討。
　　 1．腸道菌群、TEP1對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)在大劣按蚊體內(nèi)發(fā)育影響及其機(jī)制初步研究利用約氏瘧原蟲(chóng)/大劣按蚊不易感蚊模型，通過(guò)抗生素抑制蚊腸道菌群后，結(jié)果顯示給抗生素感染組蚊感染卵囊數(shù)明顯高于正常感染組蚊感染卵囊數(shù)(P<0.0001)，卵囊感染度增加7-10倍，感染率增加近1倍，說(shuō)明抗生素抑制蚊腸道菌群導(dǎo)致約氏瘧原蟲(chóng)對(duì)大劣按蚊的易感度大大增加，提示腸道菌群在瘧原蟲(chóng)感染大劣按蚊的過(guò)程中起著重要的作用。RT-PCR 結(jié)果顯示抗

5、生素處理腸道菌群后，使含硫脂蛋白1（thioester-containingproteins1， TEP1) cDNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，提示腸道菌群可能通過(guò)調(diào)節(jié)TEP1的表達(dá)影響約氏瘧原蟲(chóng)在大劣按蚊體內(nèi)的發(fā)育。
　　 我們采用RT-PCR 方法，觀察腸道菌群未經(jīng)處理情況下，檢測(cè)大劣按蚊TEP1cDNA在正常吸糖水、吸正常血和感染瘧原蟲(chóng)三種情況下的轉(zhuǎn)錄變化，結(jié)果顯示吸血和感染瘧原蟲(chóng)均可誘導(dǎo)TEP1cDNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，其中感染瘧原

6、蟲(chóng)明顯上調(diào)TEP1cDNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然而在清除腸道菌群后，瘧原蟲(chóng)感染卻無(wú)法明顯上調(diào)TEP1cDNA的表達(dá)，提示腸道菌群可能通上調(diào)TEP1激活抗瘧免疫反應(yīng)，抑制瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)發(fā)育，提示TEP1可能作為一重要效應(yīng)因子參與腸道菌群激活的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。
　　 腸道菌群未處理情況下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)按蚊TEP1進(jìn)行RNAi，結(jié)果顯示大劣按蚊蚊胃中約氏瘧原蟲(chóng)的卵囊數(shù)量增加10-15倍，感染率增加1倍，說(shuō)明在缺少TEP1的情況下，腸道菌群無(wú)法抑制

7、約氏瘧原蟲(chóng)在大劣按蚊體內(nèi)的發(fā)育，提示在腸道菌群抑制瘧原蟲(chóng)發(fā)育的過(guò)程中TEP1是必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。
　　 本研究提示按蚊腸道菌群可以通過(guò)調(diào)節(jié)TEP1的表達(dá)抑制瘧原蟲(chóng)在大劣按蚊體內(nèi)的發(fā)育；TEP1作為重要的免疫反應(yīng)因子可能參與按蚊基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，維持按蚊腸道菌群在正常水平。然而，當(dāng)瘧原蟲(chóng)入侵后引起腸道菌群變化刺激上調(diào)TEP1表達(dá)，識(shí)別并結(jié)合瘧原蟲(chóng)啟動(dòng)殺傷瘧原蟲(chóng)機(jī)制。對(duì)腸道菌群、TEP1影響約氏瘧原蟲(chóng)在按蚊體發(fā)育的機(jī)制的研究，可以改變

8、按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的易感性，可能為阻斷瘧疾在蚊期傳播提供一新的切入點(diǎn)。
　　 2、蒿甲醚影響約氏瘧原蟲(chóng)在斯氏按蚊體內(nèi)發(fā)育及其機(jī)制研究
　　 利用約氏瘧原蟲(chóng)/斯氏按蚊易感模型，斯氏按蚊吸飼蒿甲醚糖水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸飼蒿甲醚糖水斯氏按蚊體內(nèi)的卵囊數(shù)量呈3-5倍的增加，說(shuō)明蒿甲醚可以促進(jìn)并有利于約氏瘧原蟲(chóng)雌雄配子體在斯氏按蚊體內(nèi)向卵囊方向的發(fā)育。RT-PCR 結(jié)果顯示蒿甲醚明顯抑制了斯氏按蚊一氧化氮合成酶(NO synthase,NOS

9、),TEP1和前酚氧化酶(Prophenoloxidase，PPO)三個(gè)重要的蚊抗瘧原蟲(chóng)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，提示蒿甲醚可能通過(guò)抑制NO 合成和黑化包被反應(yīng)或是裂解反應(yīng)，致使斯氏按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)免疫反應(yīng)減弱，促進(jìn)瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)更好的發(fā)育。本研究通過(guò)對(duì)影響約氏瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)發(fā)育的因素及其機(jī)制的初步探討，如何降低瘧原蟲(chóng)對(duì)媒介的易感性為阻斷瘧疾的傳播提供更多的理論依據(jù)，為研制新的、高效的阻斷傳播手段提供一個(gè)新的切入點(diǎn)。同時(shí)也提示，廣泛應(yīng)用于臨床