約氏瘧原蟲表達(dá)的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子同源蛋白的功能及新瘧疫苗候選抗原的免疫研究.pdf

1、瘧疾目前仍然是世界上嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病之一,導(dǎo)致全球每年一百萬人左右死亡。瘧疾的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜,人們對它的了解十分有限。瘧原蟲能夠在宿主體內(nèi)長期存在,很大一部分原因是瘧原蟲能干擾宿主的免疫反應(yīng)和逃避宿主的免疫壓力。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是宿主分泌的一種多功能的,具有免疫調(diào)節(jié)作用的促炎性細(xì)胞因子。它可參與宿主對兇險(xiǎn)型瘧疾(Plasmodium falciparum)感染的免疫調(diào)節(jié)。有趣的是,瘧原蟲表達(dá)了一種巨噬細(xì)胞遷移

2、抑制因子的同源蛋白,它可能在瘧原蟲干擾宿主的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。本研究克隆表達(dá)來源于約氏瘧原蟲的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子同源蛋白(rPyMIF),研究其在體外對小鼠單核巨噬細(xì)胞的趨化作用和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)功能,同時(shí)也研究了rPyMIF在體內(nèi)對小鼠外周血液中游離的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示rPyMIF蛋白能夠結(jié)合在小鼠脾臟中CD11b陽性細(xì)胞(主要為單核巨噬細(xì)胞)上,并在體外抑制小鼠CD11b陽性細(xì)胞隨機(jī)遷移的能力；rPyMIF蛋白不能直接

3、誘導(dǎo)小鼠CD11b陽性細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,但能改變12S誘導(dǎo)CD11b陽性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的數(shù)量。此外研究還發(fā)現(xiàn)注射rPyMIF蛋白能使小鼠外周血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量暫時(shí)性地降低。另外我們還將rPyMIF蛋白免疫小鼠,觀察該蛋白免疫對小鼠感染致死性約氏瘧原蟲(Py17XL)的感染率和感染過程中免疫反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,在感染后第三天,rPyMIF免疫小鼠的原蟲率比對照小鼠顯著性降低。并且在感染過程中,rPyMIF蛋白免疫使更多的單核巨噬細(xì)

4、胞從骨髓遷移至脾臟,和更多的單核巨噬細(xì)胞處于激活狀態(tài)。然而,rPyMIF的免疫作用對小鼠感染Py17XL的原蟲率的影響是短暫的,在感染后第4天開始,rPyMIF免疫小鼠與對照小鼠的原蟲率沒有顯著差異。本研究結(jié)果說明約氏瘧原蟲來源的MIF對小鼠感染致死性約氏瘧原蟲(Py17XL)的原蟲率只有輕微的影響,但它能參與調(diào)節(jié)紅內(nèi)期宿主的網(wǎng)織紅細(xì)胞的產(chǎn)生和單核巨噬細(xì)胞的遷移和活化過程。
　　 由于瘧原蟲抗藥性和蚊媒耐藥性的不斷擴(kuò)展,瘧疾藥物

5、防治面臨困境,研制有效的抗瘧疫苗是當(dāng)前的迫切需要。已經(jīng)有很多瘧原蟲抗原被鑒定并進(jìn)行瘧疾疫苗的嘗試,但至今還沒有取得令人滿意的結(jié)果。最近的一項(xiàng)用分子多態(tài)性的方法篩選出幾個(gè)新的惡性瘧原蟲疫苗候選基因。為了能在動(dòng)物模型中研究瘧原蟲候選抗原的免疫保護(hù)效果,本課題研究其中一個(gè)候選抗原在約氏瘧原蟲中的同源蛋白Py01157。我們在大腸桿菌中克隆表達(dá)了Py01157蛋白相對保守的N端350個(gè)氨基酸序列(rPy01157-Nt),探索其在小鼠體內(nèi)的免疫

6、原性和其免疫作用對小鼠抵抗約氏瘧原蟲感染的保護(hù)效果。同時(shí)也觀察了Py01157蛋白在受感染紅細(xì)胞內(nèi)的定位。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rPy01157-Nt蛋白能夠被Py17XNL感染康復(fù)的小鼠血清識別,也能被非洲馬里(Mali)瘧原蟲流行區(qū)域的居民免疫血清所識別。同時(shí)rPy01157-Nt蛋白免疫的小鼠血清也能識別約氏瘧原蟲Py17XL的蟲體抗原。這些結(jié)果說明了Py01157蛋白是宿主免疫系統(tǒng)識別的蛋白之一,具有免疫原性,能使宿主產(chǎn)生抗Py

7、01157蛋白的抗體；同時(shí)也說明表達(dá)的Py01157Nt—trxA重組蛋白具有免疫原性,并且具有和天然Py01157蛋白相似的抗原表位。此外約氏瘧原蟲的Py01157蛋白和人瘧原蟲的同源蛋白還具有相似的抗原表位。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Py01157蛋白表達(dá)于瘧原蟲的細(xì)胞質(zhì)中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rPy01157-Nt蛋白的免疫對小鼠抵抗約氏非致死性瘧原蟲Py17XNL的感染有部分的保護(hù)作用,但對約氏致死性瘧原蟲Py17XL的感染沒有保護(hù)效果。

8、
　　 本課題也研究了另外一個(gè)瘧原蟲候選抗原:約氏瘧原蟲裂殖子表面蛋白9(PyMSP-9)。實(shí)驗(yàn)克隆表達(dá)了PyMSP-9 N端450個(gè)氨基酸(rPyMSP-9-Nt),其中包含了瘧原蟲MSP-9蛋白主要的保守區(qū)域；同時(shí)也構(gòu)建了PyMSP-9全基因和PyMSP-119的DNA核酸疫苗。通過重組蛋白疫苗和DNA核酸疫苗的不同組合的免疫方式,觀察其對小鼠抵抗約氏致死性瘧原蟲Py17XL的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rPyMSP-9-N