遺傳性凝血因子X(jué)缺陷和F9基因Arg327Ile突變導(dǎo)致的血友病B發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、遺傳性凝血因子X(jué) 缺陷癥和血友病B 均為單基因疾病。對(duì)該類疾病的基因診斷，能幫助找到病因和開(kāi)展針對(duì)性的治療，而對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究完善凝血機(jī)制的理論體系。
　　 凝血因子X(jué) 缺陷癥是一種常染色體隱性遺傳性出血性疾病，發(fā)病率為1/106。臨床上分為交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性（因子X(jué) 抗原和活性同時(shí)降低）和交叉反應(yīng)物質(zhì)陽(yáng)性（因子X(jué) 抗原含量基本正常，而活性明顯降低）兩種類型。本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的一例遺傳性凝血因子X(jué) 缺陷癥進(jìn)行了基因診斷和分子發(fā)病機(jī)制

2、研究。先證者凝血因子X(jué) 活性（FX:C）明顯減低（<1％），而抗原（FX:Ag）雖有降低但顯著高于活性（53％）基因診斷發(fā)現(xiàn)了F10 基因2 種新的F10 基因突變，分別為：IVS5+1G>A 和Asp368del，兩突變均為國(guó)際首次報(bào)道。針對(duì)剪接位點(diǎn)突變IVS5+1G>A抽取外周血mRNA，進(jìn)行異位轉(zhuǎn)錄本研究，并未發(fā)現(xiàn)異常剪接的轉(zhuǎn)錄本，提示IVS5+1G>A 導(dǎo)致內(nèi)含子無(wú)法正常剪接，無(wú)法合成正常mRNA，影響FX 正常表達(dá)。針對(duì)Asp

3、368del 基因突變，構(gòu)建突變型表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，Asp368del 體外表達(dá)產(chǎn)物FX:C 和FX:Ag 分別較野生型為0.52±0.04％和85.9±5.0％，提示該突變?yōu)镃RM+突變，說(shuō)明該突變蛋白能夠正常表達(dá)，但功能降低。
　　 F9 基因的突變是導(dǎo)致血友病B 的直接原因，F(xiàn)9 基因編碼的凝血因子IX（FIX）在凝血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)一例重型血友病B患者身上發(fā)現(xiàn)的突變Arg327Ile（R327

4、I）進(jìn)行了發(fā)病機(jī)制的研究。定點(diǎn)突變法構(gòu)建F9 基因R327I 突變的表達(dá)質(zhì)粒。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，細(xì)胞上清液中R327I 突變型FIX 活性（FIX:C）為野生型的4.49％，顯著降低。細(xì)胞上清液和裂解液FIX 抗原含量（FIX:Ag）分別為野生型的31 ％和129％。提示R327I 突變雖然引起FIX 合成分泌減少，但是仍能合成一部蛋白。因此通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)株，表達(dá)分離純化野生型、Arg327Ile 和Arg327Ala（R3

5、27A） FIX 重組蛋白。對(duì)所得重組FIX 被激活、與輔因子（FVIIIa）結(jié)合及激活底物（FX）三方面進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種突變蛋白均能被FVIIa/TF/Ca2+和FXIa/Ca2+正常激活。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，R327I 與R327A 兩種FIXa 突變蛋白與FVIIIa 的結(jié)合力較野生型為1/4 和1/5 倍。在含F(xiàn)Ⅷa 條件下，R327I 和R327I 突變FIXa對(duì)FX 催化效率分別為野生型1/6 和1/8。而不含F(xiàn)VIIIa