Ephrin-B2基因敲除小鼠腦損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞有利于保護(hù)組織和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù).pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain iniury,TBI)是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的疾病,是致死和致殘的主要原因,尤其是青少年。近年來(lái),隨著神經(jīng)外科治療方法和治療藥物的不斷改進(jìn)、創(chuàng)新,已顯著降低了其死亡率,提高了預(yù)后,但治療后的神經(jīng)功能恢復(fù)情況仍不太令人滿意,腦損傷后神經(jīng)功能障礙發(fā)生率較高,多數(shù)患者遺留學(xué)習(xí)記憶能力減弱、肢體功能障礙等問(wèn)題,這些嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。如何減少后遺癥,提高治療效果,尤其是認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)能力的改善,一直

2、是神經(jīng)科學(xué)界努力探索追求的目標(biāo)。近來(lái),增強(qiáng)腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)、減少繼發(fā)性炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù),愈來(lái)愈成為神經(jīng)醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。Ephrins配體及Eph受體(產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的肝細(xì)胞受體,Erythropoietin-Producing Hepatocellular Receptor)統(tǒng)稱為Eph受體家族,是新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),Ephrin-B2是該系統(tǒng)中的一名重要成員,參與神經(jīng)細(xì)胞間多種作用。在胚胎發(fā)育階段,對(duì)神經(jīng)

3、系統(tǒng)的發(fā)育及血管的生成起非常重要的作用;在成年時(shí),它仍然參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo),從而影響細(xì)胞行為和組織塑形,如誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和邊界形成,特別是在腦損傷后的修復(fù)過(guò)程中。
　　 目的:培育條件性Ephrin-B2基因敲除小鼠,敲除膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的Ephrin-B2基因;建立TBI動(dòng)物模型;探討Ephrin-B2基因在小鼠腦損傷后表達(dá)規(guī)律及神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　 方法:
　　

4、1 培育Ephrin-B2基因敲除(KO)小鼠:將GFAP-Cre基因型小鼠和Ephrin-B2-LoxP基因型小鼠進(jìn)行雜交繁殖后代,檢測(cè)子代小鼠的基因型。
　　 2 對(duì)Ephrin-B2基因敲除小鼠進(jìn)行健康檢測(cè),以C57BL/6野生型(WT)小鼠作為對(duì)照,比較神經(jīng)系統(tǒng)的大體形態(tài),星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及分布。
　　 3 選擇雄性、10～12周、重20～30g、健康的Ephrin-B2基因敲除小鼠120只,相同數(shù)量的健康

5、、雄性C57BL/6野生型小鼠作為對(duì)照,建立可控性皮層損傷模型。
　　 4 將兩種TBI小鼠,按四個(gè)時(shí)間點(diǎn):3天、7天、14天和21天各分為4組,將無(wú)損傷的小鼠作為空白對(duì)照。于各時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本,進(jìn)行以下檢測(cè):免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)腦損傷后Ephrin-B2蛋白和GFAP的表達(dá)、分布情況;Western blotting檢測(cè)損傷周圍Ephrin-B2蛋白、磷酸化的Ephrin-B2(pEphrin-B2)蛋白和GFAP的表達(dá)改變

6、;Q-PCR檢測(cè)損傷周圍及損傷同側(cè)海馬區(qū)域GFAP mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化;Nissl染色檢測(cè)損傷后21天時(shí)的損傷體積;采用平衡木行走試驗(yàn)(Beam Walking Test)和轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)(Rotarod Test)進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。
　　 5 星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷試驗(yàn):將兩種小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞Ephrin-B2蛋白和GFAP的表達(dá)情況,并檢測(cè)在損傷后兩種星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)入損傷區(qū)域

7、的細(xì)胞數(shù)目,檢測(cè)在修復(fù)過(guò)程中的不同表現(xiàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1 Ephrin-B2基因敲除小鼠表現(xiàn)形與C57BL/6野生型小鼠相似,無(wú)明顯差別:全腦的大小,重量以及形態(tài)相同,顯微鏡下檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài),大小和分布亦與野生型小鼠無(wú)差別,Western Blotting檢測(cè)顯示KO小鼠腦皮層GFAP表達(dá)略高于WT小鼠。
　　 2 免疫組織學(xué)染色顯示Ephrin-B2蛋白在WT小鼠腦損傷后21天內(nèi)在損傷周圍表達(dá)逐漸

8、增加,Ephrin-B2蛋白主要表達(dá)于GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜和突起上。KO小鼠腦損傷后損傷周圍無(wú)Ephrin-B2蛋白表達(dá)。
　　 3 Western blotting結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠腦損傷后Ephrin-B2,pEphrin-B2和GFAP的表達(dá)在損傷周圍明顯增加。盡管Ephrin-B2蛋白表達(dá)在腦損傷后第3天時(shí)稍下降,但是在3天以后逐漸升高,在21天時(shí)最高。pEphrin-B2和GFAP的表達(dá)曲線表現(xiàn)為相同的改變趨勢(shì),

9、在第7天時(shí)表達(dá)量最高。
　　 4 Western blotting結(jié)果還顯示KO小鼠在腦損傷后GFAP的表達(dá)明顯高于WT小鼠。WT小鼠GFAP的表達(dá)在第7天時(shí)最高,而KO小鼠GFAP的表達(dá)在21天內(nèi)持續(xù)升高,在第3天時(shí)KO小鼠GFAP的表達(dá)是WT小鼠的4.7倍,在第7天時(shí)是WT小鼠表達(dá)量的2.8倍,在第14和21天KO小鼠GFAP的表達(dá)仍明顯高于WT小鼠。Q-PCR方法檢測(cè)KO小鼠GFAP mRNA的表達(dá)均較WT小鼠呈明顯增加(

10、p＜0.05),無(wú)論是在損傷周圍還是在同側(cè)海馬區(qū)域,這與GFAP的表達(dá)趨勢(shì)相同。
　　 5 Nissl染色示Ephrin-B2基因敲除小鼠在腦損傷后21天時(shí)形成的損傷空洞體積較小。
　　 6 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示Ephrin-B2基因敲除后的星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后更易于分裂增殖,更快向損傷區(qū)域聚集。
　　 7 行為學(xué)評(píng)分示Ephrin-B2基因敲除小鼠在腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)較好。
　　 結(jié)論:WT小鼠腦損傷后,

11、Ephrin-B2配體在損傷周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)明顯上調(diào),信號(hào)傳導(dǎo)增加;Ephrin-B2基因敲除小鼠腦損傷后,Ephrin-B2配體不再表達(dá),致使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化迅速且明顯增多,在損傷后3天時(shí),GFAP mRNA的表達(dá)就已明顯增高,GFAP合成增加,反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞增加了神經(jīng)保護(hù)作用,減輕了繼發(fā)性組織損傷,從而促進(jìn)了損傷修復(fù)和腦神經(jīng)功能的恢復(fù),減少了后遺癥的發(fā)生。因此,如何定時(shí)定量地調(diào)節(jié)Ephrin-B2的信號(hào)傳導(dǎo),從而調(diào)控