Gadd45g基因?qū)Υ贵w瘤AtT-20細胞的增殖、凋亡和自噬的影響.pdf

1、目的:
　　探討生長阻滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因45gGadd45g對垂體瘤細胞的增殖、凋亡、自噬的影響，為應(yīng)用該基因在垂體瘤臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用原代培養(yǎng)的新生鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞，震蕩法純化星形膠質(zhì)，GFAP免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細胞。
　　2.利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，構(gòu)建Gadd45g sh RNA干擾質(zhì)粒pLKO.1-sh-Gadd45g，并進行慢病毒包裝。
　　3.克隆Ga

2、dd45g基因的CDS區(qū)序列至真核表達質(zhì)粒p3XFLAG，構(gòu)建Gadd45g真核表達載體p3XFLAG-Gadd45g。
　　4.qPCR檢測星形膠質(zhì)細胞和垂體瘤AtT-20細胞兩細胞中的Gadd45g mRNA表達水平。
　　5.本研究以干擾星形膠質(zhì)細胞Gadd45g為對照組，以恢復(fù)垂體瘤AtT-20細胞Gadd45g表達為實驗組;慢病毒pLKO.1-sh-Gadd45g感染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，qPCR檢測Gadd45

3、g mRNA干擾效率;p3XFLAG-Gadd45g轉(zhuǎn)染垂體瘤AtT-20細胞，qPCR檢測Gadd45g mRNA表達效率及Western Blot檢測融合蛋白FLAG-Gadd45g表達水平;CCK-8檢測細胞增殖率;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色后細胞流式技術(shù)檢測細胞凋亡;MDC熒光染色檢測細胞自噬活性;免疫熒光檢測細胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達情況;WesternBlot檢測細胞凋亡蛋白Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白Bec

4、lin、LC3表達情況;
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)PCR鑒定和上海生工測序表明，Gadd45g真核表達載體及其特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功;
　　2.Western blot、qPCR檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的p3XFLAG-Gadd45g載體能夠在垂體瘤AtT-20細胞中表達;qPCR檢測結(jié)果表明Gadd45g sh RNA慢病毒載體pLKO.1-sh-Gadd45g在星形膠質(zhì)細胞中具有沉默效率（干擾效率約52％，P＜

5、0.05）。
　　3.qPCR檢測星形膠質(zhì)細胞和垂體瘤AtT-20細胞兩細胞中的Gadd45g mRNA表達水平，與對照組相比，垂體瘤AtT-20細胞表達水平較低，而對照組星形膠質(zhì)細胞中Gadd45g mRNA表達水平相對較高(P＜0.05)。
　　4.恢復(fù)垂體瘤AtT-20細胞Gadd45g表達，CCK-8結(jié)果表明可抑制細胞增殖(抑制率約為70.8％，P＜0.05); Western Blot結(jié)果表明可明顯增加Caspas

6、e-3表達水平(P＜0.01);細胞流式技術(shù)結(jié)果表明可促進細胞早期凋亡(P＜0.01); Western Blot結(jié)果同樣表明了Beclin1表達水平(P＜0.05)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05); MDC熒光染色、免疫熒光結(jié)果表明可抑制細胞自噬活性。
　　5.在對照組中，靶向沉默星形膠質(zhì)細胞Gadd45g表達，CCK-8結(jié)果表明可促進促進細胞增殖(增值率約為131.06％，P＜0.05)，Western Blot結(jié)果表

7、明可明顯抑制Caspase-3表達水平(P＜0.01);細胞流式技術(shù)結(jié)果表明可抑制細胞早期凋亡(P＜0.05); Western Blot結(jié)果同樣表明了Beclin1表達水平(P＜0.01)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高(P＜0.05); MDC熒光染色、免疫熒光結(jié)果表明可增強細胞自噬活性。
　　結(jié)論:
　　垂體瘤中Gadd45g的表達缺失可能使得垂體瘤AtT-20細胞凋亡受阻及自噬作用增強，從而促進垂體瘤的發(fā)生發(fā)展?；謴?fù)垂體瘤細