Mettl9基因?qū)251膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤是臨床最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，它本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，通過一種或多種癌基因的過度表達、同時伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔亩剐盘杺鲗?dǎo)通路異常，腫瘤細胞逃逸了正常生長調(diào)控機制，結(jié)果出現(xiàn)細胞的異常增殖、自主侵襲、血管增生等惡性表型。Mettl9基因是新發(fā)現(xiàn)的一個p53下游基因，在肺癌、小鼠胎肺和SD大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中特異性表達，且該基因表達信號的強弱與凋亡細胞的強弱成正相關(guān)，其在胚胎發(fā)育過程中的作用很可能是通過參

2、與細胞凋亡來實現(xiàn)的。因此，本研究中，我們觀察不同表達水平的Mettl9基因?qū)δz質(zhì)瘤U251細胞增殖和凋亡的影響，初步探討及作用機制。
　　目的:
　　1.研究Mettl9基因的不同表達水平對U251細胞生長的影響;
　　2.探討Mettl9基因?qū)251生長的作用機制。
　　方法:
　　應(yīng)用RT-PCR方法，擴增出Mettl9基因的cDNA，克隆至pGEM(@)-T載體上并測序，再將該基因亞克隆至慢病毒載體

3、pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP，在293T細胞進行病毒包裝，構(gòu)建Mettl9基因的慢病毒過表達載體;根據(jù)RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計RNA干擾靶點序列，合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo，通過酶切連接構(gòu)建Mettl9基因的RNAi干擾載體。實驗分為五組:正常培養(yǎng)細胞組，慢病毒空載體組(NC)，慢病毒過表達載體組（Mettl9組），干擾載體對照組(NC-RNAi組)，Mettl9干擾載體組(Mettl9-RNAi組)。

4、將上述已經(jīng)構(gòu)建的各質(zhì)粒分別瞬時感染或轉(zhuǎn)染U251細胞，48h后，熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光表達情況，qRT-PCR檢測Mettl9基因的表達水平，以此評價病毒感染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Mettl9基因的表達效率;收集各組細胞，MTT方法檢測細胞活力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，qRT-PCR方法檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2，Bax mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.Mettl9 cDNA的RT-PCR擴增產(chǎn)物連接到pGEM(@

5、)-T載體，測序結(jié)果向GenBank遞交獲得收錄號HQ898855;
　　2.成功構(gòu)建了Mettl9基因的慢病毒過表達載體和RNAi干擾載體;
　　3.熒光顯微鏡下可見GFP綠色熒光的表達陽性率約為50％，感染Mettl9慢病毒過表達質(zhì)粒，Mettl9的表達水平明顯高于NC對照組）;而轉(zhuǎn)染Mettl9-RNAi組，Mettl9的表達水平明顯低于NC-RNAi組;
　　4.MTT結(jié)果顯示，感染Mettl9慢病毒過表達質(zhì)粒

6、組，細胞增殖能力明顯降低;而轉(zhuǎn)染Mettl9-RNAi組，細胞增殖能力明顯增加;
　　5.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，感染Mettl9慢病毒過表達質(zhì)粒組，細胞凋亡率明顯增加;而轉(zhuǎn)染Mettl9-RNAi組，細胞凋亡率明顯降低）;
　　6.qRT-PCR結(jié)果顯示，感染Mettl9慢病毒過表達質(zhì)粒組，凋亡相關(guān)因子Bcl-2 mRNA的表達水平降低，Bax mRNA的表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而轉(zhuǎn)染Mettl9-RNAi組，凋