ROR2在骨肉瘤組織及細胞中的表達及其對骨肉瘤細胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf

1、骨肉瘤(Oseteosarcoma)是除漿細胞瘤外最常見的惡性骨原發(fā)性腫瘤，其組織學(xué)特點是在多數(shù)情況下腫瘤細胞產(chǎn)生骨樣或不成熟骨。骨肉瘤發(fā)病率各國統(tǒng)計數(shù)字差異較大，約1/10萬-0.1/10萬。骨肉瘤易于侵及生長迅速的干骺端，其典型的位置是在長管狀骨，股骨遠端及脛骨、肱骨的近端是最常見的發(fā)病部位，全部病人的50％-70％病變發(fā)生在膝關(guān)節(jié)周圍。雖然骨肉瘤在各年齡組均有報道而且其發(fā)病率低于其他常見惡性腫瘤，但由于該病好發(fā)于青少年長骨時期，有

2、研究證實75％的骨肉瘤子10歲-30歲人群發(fā)病。起病時無明顯的臨床癥狀，極易與外傷混淆，且惡性程度高早期即可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，故其危害性大死亡率很高。臨床骨科工作者一直致力于對其防治的研究，希望尋找到骨肉瘤精確有效治療的靶點。
　　 ROR2(Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor)全稱為受體酪氨酸激酶樣孤核受體2，其屬于受體酪氨酸激酶家族(RTKs)，此激酶家族成員在動物發(fā)育的形

3、態(tài)發(fā)生及組織分化過程中具有重要意義。它們參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、粘附、遷移以及凋亡等多種細胞功能。ROR受體屬于受體酪氨酸激酶家族中的孤核受體一類，在進化上非常保守。在哺乳動物其包含兩種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白ROR1和ROR2。已有的研究證實ROR2在面部、四肢、心臟、大腦及肺等重要器官和組織中均有表達，對于神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼的發(fā)育具有重要作用。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可調(diào)節(jié)軸突的生長。在人類，ROR2基因的純合子型突變可導(dǎo)致Robinow綜合癥，此種病

4、癥表現(xiàn)出多種骨骼發(fā)育不良：身材矮小、全身肢體短小、脊柱部分節(jié)段缺失及面部骨骼畸形。ROR2基因的雜合子型突變與以手指及足趾遠節(jié)缺失為特征的brachydactyly type B綜合癥有關(guān)。在小鼠，ROR2基因的缺乏可導(dǎo)致侏儒癥、肢體及尾巴短小、面部畸形、心室間隔缺損以及引起新生兒死亡的呼吸功能障礙。已有的研究顯示ROR2可促進成骨細胞的增殖和分化，Real-time RT-PCR檢測顯示ROR2在人類骨髓間質(zhì)干細胞中無表達，隨其的成骨

5、分化逐漸增高，而當其分化為定型的前成骨細胞時ROR2的表達達到峰值，而后又迅速下降并在正常骨細胞中表達消失。ROR2受體通過二聚化而激活可促進人類間質(zhì)干細胞的成骨轉(zhuǎn)化并在組織培養(yǎng)期間增加新的骨形成。ROR2在小鼠體內(nèi)試驗時也表現(xiàn)出很強的促進骨形成的能力。以上結(jié)果均提示ROR2在骨骼的發(fā)育過程中具有重要作用。而且研究證實ROR2對于骨骼發(fā)育的影響主要是通過與WNT家族蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)經(jīng)典或非經(jīng)典WNT信號通路來實現(xiàn)。
　　 有研究顯

6、示ROR2與某些腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系。例如其在黑色素瘤組織中有較強的表達，還有研究證實ROR2是Hela宮頸癌細胞的促存活激酶。最新的研究顯示在口腔鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)ROR2的增強表達而且ROR2的高表達與其惡性程度相關(guān)以及ROR2可促進腎細胞惡性腫瘤的生長。ROR2與腫瘤之間的關(guān)系均與其可與Wnt蛋白結(jié)合，激活或調(diào)整某一WNT信號通路有關(guān)。而最近的研究顯示W(wǎng)NT通路在放射誘導(dǎo)的的骨肉瘤中具有轉(zhuǎn)錄活性。同時WNT/β連環(huán)蛋白通路的拮抗

7、劑姜黃素和PKF118-310在人類骨肉瘤細胞實驗中顯示了抗腫瘤活性。而且2008年有學(xué)者研究證實特異性酪氨酸激酶抑制劑(包括表皮生長因子受體抑制劑、胰島素樣生長因子-1受體抑制劑及met抑制劑等)可在體外抑制骨肉瘤細胞的活動能力、集落形成和侵襲能力。此結(jié)果顯示酪氨酸激酶可能調(diào)節(jié)骨肉瘤的形成及轉(zhuǎn)移，其可能成為骨肉瘤治療的新靶點。
　　 ROR2作為酪氨酸激酶家族成員的身份、其在部分腫瘤中的表達及其生物學(xué)行為、骨肉瘤的成骨特性和R

8、OR2對于骨骼發(fā)育的影響及其通過WNT信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞增殖及分化的生物學(xué)特點使得我們懷疑ROR2可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的作用，其可能促進了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性生物學(xué)行為。因此，ROR2可能成為骨肉瘤新的治療靶點。針對ROR2和骨肉瘤關(guān)系的研究將為骨肉瘤的發(fā)病機制研究和治療靶點選擇提供一條全新的思路。
　　 第一部分：ROR2在骨肉瘤組織及細胞中的表達及意義。
　　 目的：研究ROR2在骨肉瘤組織及細胞

9、中的表達情況，探討其表達的臨床意義。
　　 方法：使用Western-bloting實驗方法檢測4例骨肉瘤和3例骨軟骨瘤患者新鮮原發(fā)灶標本中ROR2表達情況；使用免疫組化方法檢測55例骨肉瘤患者和15例骨軟骨瘤患者原發(fā)灶標本中ROR2表達情況并結(jié)合患者臨床資料了解其臨床意義；使用RT-PCR實驗方法檢驗SaoS-2骨肉瘤細胞中ROR2mRNA表達情況。
　　 結(jié)果：①通過免疫組織化學(xué)的方法檢測55例骨肉瘤患者標本中有39

10、例患者標本有ROR2陽性表達，其陽性表達率為70.91％，檢測的15例骨軟骨瘤患者標本有3例ROR2陽性表達，陽性表達率為20.00％，兩者陽性表達率有顯著性差異(X2=12.73 P<0.05)。②通過Western-bloting實驗檢測新鮮骨軟骨瘤和新鮮骨肉瘤組織中ROR2蛋白表達的結(jié)果顯示兩者標本中ROR2蛋白表達有顯著性差異(P<0.05)。③通過RT-PCR實驗檢測了SaoS-2骨肉瘤細胞株中ROR2基因表達情況，結(jié)果顯示其

11、內(nèi)有ROR2基因表達。④檢測了有或無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者腫瘤標本中ROR2表達的結(jié)果顯示在有轉(zhuǎn)移的患者標本中ROR2的陽性表達率為100.00％，而在無腫瘤轉(zhuǎn)移患者標本中ROR2陽性表達率為61.91％，兩者表達陽性率有顯著性差異(x2=5.26P<0.05)。⑤檢測Ennecking分期分別為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的骨肉瘤患者腫瘤標本中ROR2表達的結(jié)果顯示ROR2在骨肉瘤Enneking分期Ⅰ期表達陽性率為22.22％(2/9)，Ⅱ期表達陽性

12、率為72.73％(24/33)，Ⅲ期表達陽性率為100.00％(13/13)。Ⅰ期與Ⅱ期間有顯著性差異(X2=5.66 P<0.05)，Ⅰ期與Ⅲ期間有顯著性差異(X2=11.46P<0.05)，而Ⅱ期與Ⅲ期間無顯著性差異(X2=2.85 P>0.05)。
　　 結(jié)論：①ROR2基因和蛋白在骨肉瘤細胞及組織中有較強表達，而且其可能影響骨肉瘤的生物學(xué)行為。
　　 第二部分：小干擾RNA對骨肉瘤細胞株ROR2基因及蛋白表達水平

13、的影響。
　　 目的：研究小干擾RNA對骨肉瘤細胞株ROR2基因及蛋白表達水平的影響。
　　 方法：使用化學(xué)合成法構(gòu)建針對ROR2的小干擾RNA，通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細胞株。使用RT-PCR和Western-bloting實驗方法檢驗其對ROR2基因及蛋白表達水平的影響。
　　 結(jié)果：①通過測序和酶切證實成功構(gòu)建了針對ROR2的小干擾RNA；②通過RT-PCR實驗檢測了干擾前后SaoS-2骨肉瘤細胞株中R

14、OR2基因表達情況，轉(zhuǎn)染后干擾組ROR2 mRNA的表達水平(0.19±0.02)明顯低于陰性對照組(0.55±0.04)和空白組(0.58±0.04)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=13.71，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=14.86，P<0.05)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(t=1.24，P>0.05)。⑨通過Western-bloting實驗檢測了干擾前后SaoS-2骨肉瘤細胞株中ROR

15、2蛋白表達情況，轉(zhuǎn)染后干擾組ROR2蛋白的表達水平(0.18±0.03)明顯低于陰性對照組(0.66±0.04)和空白組(0.84±0.03)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=7.61，<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=6.37，P<0.05P)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(t=0.31，P>0.05)。
　　 結(jié)論：①成功地合成了ROR2 siRNA并將其轉(zhuǎn)染入SaoS-2骨肉瘤細胞；②在國內(nèi)

16、首次發(fā)現(xiàn)ROR2 siRNA能下調(diào)SaoS-2骨肉瘤細胞ROR2基因和蛋白的表達水平。
　　 第三部分：ROR2對骨肉瘤細胞增殖及侵襲力的作用。
　　 目的：研究ROR2對骨肉瘤細胞增殖及侵襲力的影響，證實其在骨肉瘤中的生物學(xué)作用
　　 方法：通過細胞流式檢驗、Brdu標記實驗和transwell侵襲實驗了解ROR2 RNA干擾后骨肉瘤細胞增殖和侵襲力的變化。
　　 結(jié)果：①細胞流式檢測示RNAi后干擾組

17、細胞中S期細胞所占百分比(12.40±4.85)明顯低于陰性對照組(31.23±2.21)和空白組(26.50±2.07)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=6.12，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=4.63，P<0.05)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(t=2.71，P>0.05)。RNAi后干擾組細胞中G1期細胞所占百分比(81.47±6.56)明顯高于陰性對照組(57.87±4.65)和空白組(6

18、3.07±4.92)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=5.09，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=3.86，P<0.05)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(t=1.32，P>0.05)。②Transwell侵襲實驗示RNAi后干擾組侵襲細胞數(shù)(20.40±11.93)明顯低于陰性對照組(37.80±6.83)和空白組(44.00±7.81)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=3.70，P<0.05)

19、，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=2.83，P<0.05)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(t=1.34，P>0.05)。③Brdu標記實驗結(jié)果示RNAi后干擾組標記指數(shù)(0.14±0.03)明顯低于陰性對照組(0.32±0.02)和空白組(0.28±0.03)，干擾組和陰性對照組比較有顯著性差異(t=5.18，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=6.70，P<0.05)，而空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(