Vasohibin-1在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其生物學(xué)作用的初步研究.pdf

1、目的:研究探討Vasohibin-1(VASH1)在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特性及其與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，微血管密度(MVD，CD34標(biāo)記)以及腎細(xì)胞癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性;研究VASH1對人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、細(xì)胞周期、凋亡，以及對腎細(xì)胞癌細(xì)胞(786-0)增殖、細(xì)胞周期、凋亡、侵襲能力等一系列細(xì)胞生物學(xué)行為方面的影響，初步探討VASH1的生物學(xué)作用，以期能夠?yàn)槟I細(xì)胞癌找到新的分子標(biāo)志物和抗腫瘤血管生成

2、有效的治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)免疫組織化學(xué)染色法對46例腎細(xì)胞癌組織和20例癌旁正常腎組織中的VASH1、HIF-1α以及MVD(CD34標(biāo)記)進(jìn)行檢測，分析其在腎細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性及其與臨床病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián);(2)利用真核表達(dá)載體pReceiver-M61和含VASH1cDNA的質(zhì)粒T7-VASH1通過基因重組技術(shù)構(gòu)建pReceiver-M61-VASH1，酶切以及測序鑒定重組質(zhì)粒;利用含VASH1cDN

3、A的質(zhì)粒T7-VASH1、GV287慢病毒系列載體、pHelper1.0載體和pHelper2.0載體三質(zhì)粒組成的慢病毒載體系統(tǒng)來獲得過表達(dá)VASH1的慢病毒顆粒，PCR以及測序鑒定重組質(zhì)粒，定量PCR檢測病毒滴度;(3)將pReceiver-M61-VASH1轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀以及Transwell小室研究探討過表達(dá)VASH1對HUVEC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡以及對786-0細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期

4、、凋亡、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:(1)在癌旁正常腎組織中，VASH1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，部分表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞;在腎細(xì)胞癌組織中，VASH1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜，部分表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜;VASH1在癌旁正常腎組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于腎細(xì)胞癌組織(P＜0.05)，VASH1的表達(dá)在不同組織學(xué)類型，不同臨床分期的腎細(xì)胞癌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著腫瘤惡性程度的增加其表達(dá)強(qiáng)度呈

5、下降趨勢(P＜0.05);VASH1，HIF-1α及MVD在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相互關(guān)系顯示，VASH1與HIF-1α具有顯著負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，VASH1與MVD具有顯著負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，HIF-1α與MVD具有顯著正相關(guān)性(P＜0.05)。(2)重組pReceiver-M61-VASH1經(jīng)過酶切以及測序鑒定證實(shí)VASH1cDNA片段正確地插入真核表達(dá)載體pReceiver-M61中;重組GV287-VASH1經(jīng)PCR以

6、及測序鑒定證實(shí)VASH1cDNA片段正確地插入慢病毒表達(dá)載體GV287中，包裝、純化、濃縮后的慢病毒濃縮液經(jīng)定量PCR檢測后證實(shí)得到病毒滴度為2.00E+8TU/ml的重組慢病毒顆粒。(3)Western blot結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細(xì)胞后，與正常細(xì)胞組和對照組相比，過表達(dá)組HUVEC和786-0細(xì)胞中VASH1蛋白的表達(dá)量明顯增多(P＜0.05);MTT結(jié)果顯示pReceiver-

7、M61-VASH1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細(xì)胞48小時后，與正常細(xì)胞和對照相比，過表達(dá)VASH1的HUVEC和786-0細(xì)胞的OD值均顯著降低(P＜0.05）;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細(xì)胞48小時后，與正常細(xì)胞和對照相比，過表達(dá)VASH1的HUVEC和786-0細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例均增多，S期細(xì)胞比例均減少，細(xì)胞周期均阻滯于G0/G1期(P＜0

8、.05）;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細(xì)胞48小時后，與正常細(xì)胞和對照相比，過表達(dá)VASH1的HUVEC和786-0細(xì)胞的凋亡比率均顯著增加(P＜0.05);Transwell小室檢測pReceiver-M61-VASH1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞48小時后，過表達(dá)VASH1的786-0細(xì)胞與正常細(xì)胞和對照相比，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)未表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05）。<

9、br>　　結(jié)論:(1)VASH1在腎細(xì)胞癌中并非只由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其也可由其他細(xì)胞產(chǎn)生;VASH1在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)與HIF-1α，MVD以及臨床病理特征存在一定相關(guān)性，其隨著腫瘤惡性程度的增加其表達(dá)強(qiáng)度呈下降趨勢。(2)含VASH1cDNA的重組質(zhì)粒pReceiver-M61-VASH1在體外能夠有效地促進(jìn)VASH1蛋白在HUVEC中的表達(dá)。HUVEC過表達(dá)VASH1后可以有效地抑制HUVEC細(xì)胞在體外的增殖，使HUVEC細(xì)胞周期

10、阻滯于G0/G1期以及誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生細(xì)胞凋亡。(3)含VASH1cDNA的重組質(zhì)粒pReceiver-M61-VASH1在體外能夠有效地促進(jìn)VASH1蛋白在786-0細(xì)胞中的表達(dá)。786-0細(xì)胞過表達(dá)VASH1后可以有效地抑制786-0細(xì)胞在體外的增殖，使786-0細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期以及誘導(dǎo)786-0細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。(4)VASH1在腎細(xì)胞癌組織中的低表達(dá)可能參與了腎細(xì)胞癌血管生成的發(fā)生、發(fā)展，VASH1有望成為腎細(xì)