TMPRSS4通過誘導EMT增強肝細胞癌侵襲能力的研究.pdf

1、目的:
　　肝癌術后的復發(fā)轉移是進一步提高人肝癌遠期療效的瓶頸。已有研究表明上皮間質(zhì)轉化(epithelialmesenchymaltransitions，EMT)是人肝癌發(fā)生侵襲轉移的重要原因，但其作用機制尚不明確。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，在不同轉移潛能肝癌組織內(nèi)，TMPRSS4及EMT相關基因產(chǎn)物E-cadherin、vimentin和fibronectin的表達情況:TMPRSS4表達高的肝癌組織中E-cadherin表達降低，

2、而vimentin和fibronectin的表達升高。提示TMPRSS4與肝癌EMT的發(fā)生可能存在一定的相關性。本實驗著重研究TMPRSS4在肝癌EMT發(fā)生中的作用及其相關機制，應用慢病毒轉染技術調(diào)控肝癌細胞BEL-7402中TMPRSS4的表達，觀察TMPRSS4對肝癌細胞侵襲轉移潛能及EMT相關基因產(chǎn)物表達的影響，明確TMPRSS4在肝癌EMT發(fā)生及侵襲轉移中的作用，從而為預測肝癌的復發(fā)轉移和靶向治療提供新的思路。
　　方法:

3、
　　1.構建細胞株
　　構建慢病毒載體LV-TMPRSS4，將其轉染BEL-7402人肝癌細胞株，建立過表達TMPRSS4的BEL-7402細胞株。
　　2.實驗分組
　　實驗組分為正常BEL-7402對照組(control)、LV-GFP空白載體對照組(LV-GFP)、LV-TMPRSS4過表達組(LV-TMPRSS4)。
　　3.觀察指標
　　BEL-7402人肝癌細胞轉染慢病毒載體LV-TMP

4、RSS4后觀察細胞形態(tài)學變化，用RT-PCR及WesternBlot檢測轉染后TMPRSS4表達情況。用CCK-8、Transwell、WesternBlot等技術檢測細胞過表達TMPRSS4后其增殖、侵襲能力的變化以及EMT相關基因產(chǎn)物如E-cadherin、Vimentin、Fibronectin表達變化。
　　結果:
　　1.轉染后TMPRSS4表達增強
　　RT-PCR顯示轉染后，LV-TMPRSS4組細胞TM

5、PRSS4mRNA表達增強。WesternBlot結果顯示，與正常對照組和LV-GFP空白載體組比較，LV-TMPRSS4過表達組細胞TMPRSS4蛋白表達顯著增強，而正常對照組與LV-GFP空白載體組TMPRSS4蛋白表達無明顯差異。說明人肝細胞癌細胞株BEL-7402轉染目的基因TMPRSS4成功。
　　2.BEL-7402細胞過表達TMPRSS4后形態(tài)學變化
　　BEL-7402人肝癌細胞轉染LV-TMPRSS4后細胞

6、形態(tài)變化明顯，由原來的卵石型變?yōu)殚L梭型。
　　3.BEL-7402細胞過表達TMPRSS4后增殖能力無明顯變化
　　CCK-8實驗結果顯示，正常對照組、LV-GFP空白載體對照組及LV-TMPRSS4過表達組細胞增殖能力無顯著差異(P＞0.05)。說明TMPRSS4過表達對BEL-7402細胞株的增殖無顯著影響。
　　4.BEL-7402細胞過表達TMPRSS4后遷移能力顯著增強
　　細胞劃痕實驗檢測三組細胞的遷

7、移能力，發(fā)現(xiàn)LV-TMPRSS4過表達組細胞遷移能力顯著加強，而正常對照組和LV-GFP空白載體對照組之間無顯著差異。
　　5.BEL-7402細胞過表達TMPRSS4后侵襲能力增強
　　transwell侵襲實驗顯示LV-TMPRSS4過表達組細胞穿過Matrigel膠到達Transwell小室膜背面的細胞數(shù)為44.0±2.6，顯著高于正常對照組(15.7±2.1)和LV-GFP空白載體對照組(16.7±2.1)(P＜0.

8、05)。提示TMPRSS4過表達后BEL-7402細胞的侵襲能力明顯增強。
　　6.BEL-7402細胞過表達TMPRSS4后EMT相關基因產(chǎn)物表達變化
　　WesternBlot結果顯示，與正常對照組和LV-GFP空白載體對照組相比，LV-TMPRSS4過表達組細胞E-cadherin表達明顯降低，Vimentin、Fibronectin表達升高。
　　結論:
　　1.TMPRSS4過表達可使人肝細胞癌細胞株B

9、EL-7402的細胞形態(tài)由卵石型轉變?yōu)殚L梭型，利于腫瘤細胞向周圍及遠處侵襲轉移。
　　2.TMPRSS4過表達可顯著增強BEL-7402細胞的遷移和侵襲能力，但不影響細胞增殖。
　　3.TMPRSS4過表達使BEL-7402細胞中EMT相關蛋白E-cadherin表達降低而Vimentin和Fibronectin表達升高，提示TMPRSS4可誘導BEL-7402細胞發(fā)生EMT而促進肝癌的侵襲轉移。
　　4.TMPRSS