ECSCR通過TGFβ1信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球最為常見的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后惡劣、死亡率高等特點(diǎn)，是全球第三大癌癥死因，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命與健康。綜觀肝癌治療現(xiàn)狀，其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍居高不下，已嚴(yán)重制約肝癌患者長(zhǎng)期生存率的提高。因此，深入開展肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究將有助于探索新的肝癌干預(yù)治療措施，進(jìn)一步提高肝癌的治療水平。
　　內(nèi)皮細(xì)胞特異性趨化調(diào)節(jié)因子(endothelial cell-speci

2、ficchemotaxis regulator，ECSCR)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)單程跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的內(nèi)皮細(xì)胞和血管。已有研究表明，ECSCR能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞粘附，抑制細(xì)胞遷移等。因而我們推測(cè)ECSCR可能在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡和遷移運(yùn)動(dòng)發(fā)揮重要作用。
　　研究目的：
　　研究人肝癌中ECSCR的表達(dá)情況，探討其與肝癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系;通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ECSCR在肝

3、癌中的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　　1、ECSCR在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中均呈顯著低表達(dá)。首先我們采用Real-time PCR、RT-PCR和Western-blot檢測(cè)了肝癌組織及其相應(yīng)的鄰近非瘤肝組織中ECSCR的表達(dá)。結(jié)果顯示，與鄰近非瘤肝組織相比，ECSCR mRNA在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平的中位值為0.2912(以鄰近非瘤肝組織中ECSCRmRNA的表達(dá)水平為1)，且ECSCR mRNA(0.

4、271±0.064 vs.1.271±0.153,P＜0.05)和蛋白(0.234±0.047 vs.1.097±0.196，P＜0.05)均在肝癌組織中呈顯著性低表達(dá)。同時(shí)我們采用Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)了正常肝細(xì)胞系L02及HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L和HCCLM3等肝癌細(xì)胞系中ECSCR的表達(dá)。結(jié)果顯示ECSCR在L02中的表達(dá)顯著高于其他肝癌細(xì)胞系(P＜0.05）。
　　

5、2、ECSCR低表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。我們采用免疫組化法檢測(cè)了97例肝癌組織中ECSCR的表達(dá)，結(jié)果顯示肝癌組織中ECSCR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于鄰近非瘤肝組織(59.8％ vs.100.0％，P＜0.001)，且其表達(dá)水平與肝癌大小(P=0.036)、結(jié)節(jié)數(shù)(P＜0.001)、包膜或假包膜(P=0.001)、靜脈侵犯(P=0.001)、巴塞羅那分期(P=0.002)、TNM分期(P＜0.001)及肝癌臨床分型(P=0.

6、001)等臨床病理特征密切相關(guān)。同時(shí)，ECSCR低表達(dá)組的無瘤生存時(shí)間(22.5±3.4 vs.41.2±3.6月，P=0.002)及總體生存時(shí)間(31.1±4.6 vs.49.0±3.2月，P=0.005)均明顯短于ECSCR高表達(dá)組。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，ECSCR低表達(dá)(HR=2.183，P=0.040)與靜脈侵犯(HR=3.054，P=0.015)、包膜或假包膜(HR=4.239，P=0.004)、巴塞羅那分期(HR

7、=2.469，P=0.046)、TNM分期(HR=2.768，P=0.014)及肝癌臨床分型(HR=2.368，P=0.038)等是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示ECSCR的低表達(dá)預(yù)示肝癌患者不良預(yù)后。
　　3、ECSCR在體外能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲運(yùn)動(dòng)能力。我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)ECSCR的SMMC-7721ECSCR和HCCLM3ECSCR細(xì)胞系，以及對(duì)照組SMMC-7721Control和HCCL

8、M3Control細(xì)胞系。體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ECSCR過表達(dá)組SMMC-7721ECSCR和HCCLM3ECSCR細(xì)胞的增殖速度分別明顯低于相應(yīng)的對(duì)照組SMMC-7721Control和HCCLM3Control細(xì)胞(P＜0.01），集落形成數(shù)也分別明顯低于相應(yīng)對(duì)照組(109±22 vs.480±37，P＜0.01;80±12 vs.255±17，P＜0.01);而且ECSCR過表達(dá)組的劃痕愈合率也分別明顯低于相應(yīng)對(duì)照組(47％

9、vs.96％，P＜0.001;27％ vs.86％，P＜0.001); Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ECSCR過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲能力較相應(yīng)對(duì)照組也明顯下降(33±8 vs.134±11，P＜0.001;12±4 vs.56±7, P＜0.001)。
　　4、ECSCR通過抑制TGFβ1信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲運(yùn)動(dòng)。我們首先采用腫瘤常見信號(hào)通路篩選試劑盒對(duì)ECSCR過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞中信號(hào)通路的表達(dá)活性進(jìn)行篩選，結(jié)果顯

10、示ECSCR過表達(dá)組細(xì)胞中TGFβ信號(hào)通路的表達(dá)活性明顯下調(diào)(P＜0.01)。繼而我們采用Western-blot進(jìn)一步檢測(cè)TGFβ信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞中TGFβ1(0.154±0.024 vs.1.014±0.127, P＜0.05)、p-ERK(0.479±0.093 vs.2.118±0.406, P＜0.05)和p-Smad2/3蛋白(0.249±0.048 vs.1.471±0.215，P＜0.05)的

11、表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而ERK(0.977±0.208 vs.1.012±0.241，P=0.836)和Smad2/3蛋白(1.053±0.312 vs.0.979±0.283，P=0.903)的表達(dá)水平無明顯改變。細(xì)胞骨架免疫熒光染色的結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)舒展、多樣，伸出大量偽足;而ECSCR過表達(dá)組細(xì)胞的形態(tài)攣縮。
　　5、ECSCR在體內(nèi)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。我們建立了HCCLM3人肝癌細(xì)胞系裸鼠原位肝癌轉(zhuǎn)移模型

12、。結(jié)果顯示，HCCLM3ECSCR組裸鼠的皮下瘤體積明顯小于HCCLM3Control組(0.24±0.15 vs.0.72±0.39 cm3，P＜0.05)，且其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率(33.3％ vs.83.3％，P＜0.05)和肺轉(zhuǎn)移率(16.7％ vs.66.7％，P＜0.05)均明顯低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)ECSCR在人肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中均呈顯著低表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。上調(diào)