胰腺癌預(yù)后多因素分析、siRNA干擾TMPRSS4表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的影響.pdf

1、第一章：胰腺癌預(yù)后多因素分析
　　 前言：胰腺癌為消化系統(tǒng)高度惡性腫瘤，發(fā)病率為癌癥發(fā)病率的2.5％，位于第十位，但死亡率為所有癌癥病人死亡率的6％，位于第四位，中位生存期僅為3～6個(gè)月，總的五年生存率不足5％。胰腺癌在確診的時(shí)候多半已經(jīng)轉(zhuǎn)移，而手術(shù)為治療胰腺癌的最為有效的手段，僅有15％～20％的可切除率。因此提高胰腺痛早期診斷率和病人生存率為臨床研究的重要課題。
　　 目的：探討胰腺癌的流行病學(xué)、臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢查

2、、影像學(xué)檢查，為早期診斷提供新思路，探討影響胰腺痛預(yù)后的因素，為提高病人生存率提供新方法。
　　 方法：收集2002年1月至2007年1月我院收治的有完整隨訪資料的280例胰腺癌患者，對(duì)所有病例進(jìn)行病例資料收集并隨訪。采用Kaplan-Meier及壽命表計(jì)算生存率，log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行影響預(yù)后的單因素分析，對(duì)符合條件的納入COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。
　　 結(jié)果：本組病例中，91.8％患者的年齡大于40歲，高峰

3、年齡在50-73歲之間；89.3％患者進(jìn)行聯(lián)合B超和CT檢查，敏感性分別為70.6％、95.3％，CA-199敏感性為80.8％。中位生存期為(7.00±0.52)個(gè)月，1-5年生存率分別為28.0％、9.0％、6.0％、2.0％、1.0％。單因素分析結(jié)果提示年齡>65歲、CA-199>均數(shù)、TNM Ⅲ期、Ⅳ期、淋巴結(jié)侵犯、大血管侵犯、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、非手術(shù)治療、KPS評(píng)分<60、無(wú)黃疸、有腹水、無(wú)胰腺病史、體重下降()5Kg、胰體位癌等

4、都是預(yù)后不良的因素；COX多因素分析結(jié)果表明，治療方式、年齡、TNM分期、KPS評(píng)分和有無(wú)腹水是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論：1、胰腺癌惡性程度高，早期診斷率低，確診時(shí)僅16.8％有根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，55.7％已經(jīng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，胰腺體尾部癌較胰頭癌更易轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移最多的器官為肝臟，轉(zhuǎn)移與性別年齡無(wú)關(guān)。2、不斷更新的用于胰腺痛的診斷技術(shù)并沒(méi)有明顯提高早期診斷率與生存率，重視對(duì)胰腺癌高危人群的監(jiān)測(cè)為胰腺癌早期診斷的可靠方法。<

5、br>　　 第二章：siRNA干擾TMPRSS4表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的影響
　　 前言：高度惡性和轉(zhuǎn)移是胰腺痛的突出特征之一。胰腺為腹膜后位器官，胰腺癌患者早期癥狀缺乏特異性，由于早期診斷困難，療效差。所以，尋找新的治療思路，以提高胰腺痛患者的預(yù)后及生活質(zhì)量成為亟待解決的問(wèn)題。
　　 早期易侵犯周圍組織器官和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胰腺癌的生物特性，同時(shí)也是胰腺痛患者預(yù)后極差的最主要因?yàn)?。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前

6、已闡明的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移主要是腫瘤細(xì)胞侵犯和破壞周圍正常組織的過(guò)程，其中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。以蛋白水解方式來(lái)降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移鋪平道路，是腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的必需步驟，這一過(guò)程主要由四類內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金屬蛋白酶。腫瘤轉(zhuǎn)移方面的最新研究認(rèn)為在絲氨酸蛋白酶中，TTSP家族在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)雜過(guò)程中可能有重要作用。Ⅱ型跨膜絲氨

7、酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine proteases，TTSP)屬于一類絲氨酸蛋白酶，表達(dá)在某些器官和腫瘤組織的細(xì)胞表面中，具有潛在的降解細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)的功能，從而有利于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)不少研究發(fā)現(xiàn)部分TTSPs在某些腫瘤出現(xiàn)表達(dá)改變，認(rèn)為可能與這些腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 TMPRSS4是Wallrapp等在2000年從胰腺癌中通過(guò)cDNA-RDA方法分離出的糜蛋白

8、家族中的一個(gè)新的絲氨酸蛋白酶，屬于TTSP的新成員，在胰腺痛及其他腫瘤中高表達(dá)，蛋白結(jié)構(gòu)上具備所有TTSP的結(jié)構(gòu)特征。功能上有胰酶樣活性，可能在腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤(rùn)中有重要作用。H，jung等人研究證實(shí)，TMPRSS4過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘連喪失，從而促進(jìn)表皮細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞間過(guò)渡，造成痛細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力、侵襲性和惡性程度都明顯增加。這些研究結(jié)果都提示TMPRSS4正向參與了胰腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的致病過(guò)程，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。TMPRSS

9、4是否可以作為胰腺癌診斷與預(yù)后評(píng)價(jià)的新指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。
　　 基于這些研究背景，本實(shí)驗(yàn)擬在已有研究的基礎(chǔ)上，研究胰腺痛組織中TMPRSS4的表達(dá)及臨床意義；通過(guò)RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)阻斷胰腺痛SW1990細(xì)胞中TMPRSSS4基因的功能表達(dá)，研究沉默TMPRSS4后細(xì)胞的增殖及侵襲行為的變化，為闡明TMPRSS4與胰腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的正向關(guān)系提供證據(jù)，并為臨床上胰腺痛TMPRSSS4基因治療

10、提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：檢測(cè)胰腺癌組織中Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶4(type Ⅱ transmembraneserine proteases 4，TMPRSS4)的表達(dá)及臨床意義。構(gòu)建靶向TMPRSS4特異性干擾RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞后，培養(yǎng)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞株，研究RNA干擾(RNA interference，RNAi)對(duì)胰腺痛SW1990細(xì)胞TMPRSS4基因、蛋白以及細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的影響，為將來(lái)進(jìn)一步研究T

11、MPRSS4在胰腺癌中的生物學(xué)功能及胰腺痛抗遷移與侵襲治療提供基礎(chǔ)。
　　 方法：RT-PCR檢測(cè)組織中TMPRSS4的表達(dá)，初步探討TMPRSS4在胰腺癌病人中表達(dá)的差異。構(gòu)建靶向TMPRSS4基因的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuantitative Polymerase ChainReaction，RQ-PCR

12、)檢測(cè)各質(zhì)粒載體對(duì)TMPRSS4基因的干擾效率，篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒載體，并進(jìn)行穩(wěn)定克隆篩選培養(yǎng)，Western-blot進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平，Transwell小室檢測(cè)TMPRSS4沉默后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變；CCK-8法檢測(cè)TMPRSS4沉默后細(xì)胞體外增殖的變化。
　　 結(jié)果：9例確診為胰腺癌，TMPRSS4陽(yáng)性6例，陽(yáng)性率為66.7％，3例慢性胰腺炎組織TMPRSS4表達(dá)均陰性。5例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織TMPR

13、SS4表達(dá)均陽(yáng)性，3例無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者1例陽(yáng)性。胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組TMPRSS4陽(yáng)性率高于非轉(zhuǎn)移組。熒光定量PCR、westen-blot分別檢測(cè)TMPRSS4的干擾效率為80.1％、60％。Transwell小室檢測(cè)SW1990/p-siTMPRSS4組細(xì)胞的遷移抑制率與侵襲抑制率分別為32.1％、24.5％；CCK8檢測(cè)空白對(duì)照組、空載體組與TMPRSS4組細(xì)胞增殖狀態(tài)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：TMPRSS4的陽(yáng)