25OHD-,3--1α羥化酶(CYP27B1)突變基因的功能研究.pdf

1、目的:
　　 假性維生素D缺乏性佝僂病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets，PDDR)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，系編碼250HD31α羥化酶的CYP2781基因突變所致，目前基因突變已發(fā)現(xiàn)近四十種，本組前期的研究首次在5名中國PDDR患者中發(fā)現(xiàn)了4個新突變，但這幾個突變對25OHD31α羥化酶的功能影響尚未證實。因此本實驗的主要目的是在構建CYP27B1體外過表達體系的基礎上，研究我

2、組新發(fā)現(xiàn)的2個錯義突變G57V和L333F對250HD31α羥化酶活性的影響，進而加深臨床醫(yī)生對于突變型和臨床表型關系的認識。
　　 方法:
　　 1.通過定點誘變將突變引入連接在質(zhì)粒載體pCMVXL5上的CYP27B1cDNA，構建突變型CYP2781基因G57V和L333F，并在體外大量擴增，得到大量的載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒DNA。
　　 2.通過陽離子脂質(zhì)體法轉染載有野生型和突變型基因的質(zhì)粒至293T

3、人胚腎細胞，構建CYP27B1野生型和突變型基因的體外過表達體系
　　 3.轉染36小時后，向細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的底物25OHD3，然后放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，使野生型和突變型酶在適當條件下進行體外羥化反應:
　　 4.收集細胞培養(yǎng)液，經(jīng)過提取和C18柱純化，用放免法對不同類型的細胞培養(yǎng)液進行250HD3和1，25(OH)2D3濃度的檢測，通過SPSS析因分析，比較突變型與野生型不同基因型之間是否存在顯著差異

4、r>　　 5.收集完細胞培養(yǎng)液后將細胞提取總蛋白，通過western blot檢測驗證野生型和突變型的蛋白在體外是否有表達及表達水平是否一致。
　　 結果:
　　 1.CYP2781野生型和突變型基因在293T細胞體外過表達體系中均有所表達，而且表達水平一致。
　　 2.體外過表達的野生型和突變型CYP2781均具酶活性，可以產(chǎn)生1，25(OH)2D3并被檢測到，突變型CYP2781組1，25(OH)2D3水平