甘藍型油菜烷羥化酶基因BnMAH1-1、BnMAH1-2的克隆、表達分析與載體構建.pdf

1、植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一層屏障。MAH1基因是細胞色素P450中CYP96家族成員之一。在擬南芥中，MAH1被認為編碼植物角質(zhì)層蠟質(zhì)脫羰基途徑中的烷羥化酶，催化烷烴羥基化形成次級醇和酮，而 MAH1在甘藍型油菜中的研究還未見報道。本試驗通過電子克隆與RT-PCR技術，分離獲得了兩個甘藍型油菜MAH1的全長編碼區(qū)序列，分別命名為BnMAH1-1和BnMAH1-2，并進行了相關生物信息學的分析與預測；通過實時熒光定量 PC

2、R技術檢測了這兩個成員的組織器官特異性表達特征，激素處理后的誘導表達模式，并通過比較這兩個基因成員在有蠟粉與無蠟粉材料中的表達差異初步探索了在蠟質(zhì)合成中的功能；同時，利用雙酶切技術構建了BnMAH1-1的超表達載體和RNAi載體，為進一步利用轉基因功能研究奠定基礎。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/203），以擬南芥MAH1基因序列為探針，

3、電子克隆得到2個 ORF序列。通過PCR和RT-PCR方法從甘藍型油菜中克隆得到了這兩個ORF序列，分別命名為BnMAH1-1（基因登錄號：KT795344）和BnMAH1-2（基因登錄號：KT795345），其ORF長度均為1491bp，無內(nèi)含子，G+C含量均為43.1％，二者的核苷酸序列一致性為92.4%，與擬南芥 MAH1基因一致性分別為85%和86.4%。二者在氨基酸水平上有90.9%的序列一致性和94.0%的相似性。NCBI

4、blastn與氨基酸序列多重比表明兩者與預測的甘藍的MAH1同源性最高，其次是白菜，然后是擬南芥 MAH1。通過 P450親緣系統(tǒng)發(fā)生進化樹表明，BnMAH1-1和BnMAH1-2與擬南芥MAH1/CYP96A15親緣關系最近。根據(jù)核苷酸預測的BnMAH1-1和 BnMAH1-2預前體蛋白均為496個氨基酸組成的多肽鏈，分子量（Mw）分別為57.06kDa和56.92kDa，等電點分別為8.76和8.33。預測的BnMAH1-1和 Bn

5、MAH1-2蛋白均為親水蛋白，存在信號肽序列。BnMAH1-1和 BnMAH1-2二級結構主要由α螺旋（38.10%、40.12%）和無規(guī)則卷曲（35.28%、32.66%）構成，而β轉角（8.27%、8.06）和延伸鏈（18.35%、19.15%）散布于整個蛋白質(zhì)中。三級結構預測表明 BnMAH1-1和BnMAH1-2均是細胞色素 P450蛋白，并且含有一個保守的血紅素結合域F436xxGxRxCxG445。⑵實時熒光定量PCR以及半

6、定量結果分析表明，BnMAH1-1與BnMAH1-2基因在甘藍型油菜根、莖、葉、花、及角果中均有表達，其中在葉片中的表達量最高，其次是角果與莖，二者在根系中的表達量最低。這表明 BnMAH1-1和BnMAH1-2可能活躍地參與了甘藍型油菜地上部分、尤其是葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積。對BnMAH1-1和BnMAH1-2在有蠟粉材料與無蠟粉材料中的差異表達分析結果表明，BnMAH1在有蠟粉材料莖、葉中的表達量遠遠高于無蠟粉材料，BnMAH1-1和

7、 BnMAH1-2在無蠟粉材料葉片中幾乎不表達，表明蠟質(zhì)的減少與MAH1的轉錄下調(diào)有關。外源激素 MeJA誘導6h后，BnMAH1與 JA信號途徑標志基因PDF1-2在渝油19中表達顯著上調(diào)，在中雙9中表達均下調(diào)。乙烯合成促進劑 ACC顯著誘導了乙烯信號途徑標志基因 ERF2的表達，BnMAH1在渝油19中表達無顯著變化，在中雙9中表達下調(diào)。SA處理6h后，SA信號途徑標志基因PR1表達顯著上調(diào)，而BnMAH1在兩品種中表達均下調(diào)。⑶設

8、計了帶有 SacI/ XmaI酶切位點序列的PCR引物，從油菜總cDNA中擴增獲得 BnMAH1-1的全長編碼序列，經(jīng)測序驗證正確后，利用 XmaI+SacI雙酶切技術將超表達序列最終克隆到pCambia2301G載體上，得到了攜帶目的基因的重組載體 pCambia2301G-BnMAH1-1，依次轉化大腸桿菌及根癌農(nóng)桿菌 LBA4404，獲得了攜帶BnMAH1-1的植物超表達載體的工程菌株。根據(jù)BnMAH1-1的保守區(qū)域設計 RNAi

9、片段引物，利用 PCR克隆 RNAi片段，將其反義片段與正義片段采用NocI+AatII和BamHI+XbaI分別插入到植物RNAi基礎載體pFGC5941M的啟動子與間隔區(qū)、間隔區(qū)與終止子之間，形成重組RNAi載體pFGC5941M-BMAH1-1I，PCR檢測表明載體構建成功，并轉化根癌農(nóng)桿菌獲得工程菌株。超表達載體與 RNAi載體的構建為進一步通過植物轉化進行基因功能研究奠定基礎。⑷通過農(nóng)桿菌介導法，將甘藍型油菜烷羥化酶基因 Bn