赭曲霉甾體11α--羥化酶基因的功能鑒定及其過表達.pdf

1、微生物甾體C11羥基化反應是甾體藥物生產的關鍵技術。赭曲霉在工業(yè)上用于催化16α，17α-環(huán)氧黃體酮C11α-羥化反應，合成重要糖皮質激素類藥物中間體C11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧黃體酮。11α-羥基-左旋乙基雙酮是合成第三代避孕藥地索高諾酮的關鍵中間體，但因赭曲霉對左旋乙基雙酮C11α-羥化反應特異性偏低，副產物偏高，限制了其用于11α-羥基-左旋乙基雙酮合成。然而有關赭曲霉對以上兩種甾體底物存在明顯不同的C11α-羥化反應特異

2、性的分子基礎并不清楚，妨礙了對赭曲霉菌株的定向遺傳改造。
　　為了探究赭曲霉甾體11α-羥基化反應活性的遺傳基礎，本文首先明確了赭曲霉甾體C11α-羥化活性受甾體底物的誘導;通過轉錄組測序和qRT-PCR分析確定了基因CYP68J5和CYP68L8的表達受甾體底物的高度誘導。釀酒酵母功能表達試驗表明CYP68J5編碼目標甾體C11α-羥化酶?；蚨ㄏ蚯贸Y果揭示CYP68J5是參與赭曲霉甾體羥基化的唯一基因，同時也表明赭曲霉對左旋

3、乙基雙酮C11α-羥化反應的低特異性是由CYP68J5基因產物本身酶學性質所決定，而不是由于其他基因的參與。以上結果為利用定向進化對CYP68J5進行遺傳改造，獲得具有高特異性的左旋乙基雙酮C11α-羥化酶提供了理論依據(jù)。同時，為了提高現(xiàn)有赭曲生產菌種的轉化工藝效率，本文研究了增加C11α-羥化酶基因的CYP68J5拷貝數(shù)對16α，17α-環(huán)氧黃體酮的轉化效率的影響。試驗表明多拷貝重組菌株在搖瓶條件下轉化率比現(xiàn)有生產菌株提高10％以上，