赭曲霉甾體11α--羥化酶基因的功能鑒定及其過表達(dá).pdf

1、微生物甾體C11羥基化反應(yīng)是甾體藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。赭曲霉在工業(yè)上用于催化16α，17α-環(huán)氧黃體酮C11α-羥化反應(yīng)，合成重要糖皮質(zhì)激素類藥物中間體C11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧黃體酮。11α-羥基-左旋乙基雙酮是合成第三代避孕藥地索高諾酮的關(guān)鍵中間體，但因赭曲霉對左旋乙基雙酮C11α-羥化反應(yīng)特異性偏低，副產(chǎn)物偏高，限制了其用于11α-羥基-左旋乙基雙酮合成。然而有關(guān)赭曲霉對以上兩種甾體底物存在明顯不同的C11α-羥化反應(yīng)特異

2、性的分子基礎(chǔ)并不清楚，妨礙了對赭曲霉菌株的定向遺傳改造。
　　為了探究赭曲霉甾體11α-羥基化反應(yīng)活性的遺傳基礎(chǔ)，本文首先明確了赭曲霉甾體C11α-羥化活性受甾體底物的誘導(dǎo);通過轉(zhuǎn)錄組測序和qRT-PCR分析確定了基因CYP68J5和CYP68L8的表達(dá)受甾體底物的高度誘導(dǎo)。釀酒酵母功能表達(dá)試驗表明CYP68J5編碼目標(biāo)甾體C11α-羥化酶?；蚨ㄏ蚯贸Y(jié)果揭示CYP68J5是參與赭曲霉甾體羥基化的唯一基因，同時也表明赭曲霉對左旋

3、乙基雙酮C11α-羥化反應(yīng)的低特異性是由CYP68J5基因產(chǎn)物本身酶學(xué)性質(zhì)所決定，而不是由于其他基因的參與。以上結(jié)果為利用定向進(jìn)化對CYP68J5進(jìn)行遺傳改造，獲得具有高特異性的左旋乙基雙酮C11α-羥化酶提供了理論依據(jù)。同時，為了提高現(xiàn)有赭曲生產(chǎn)菌種的轉(zhuǎn)化工藝效率，本文研究了增加C11α-羥化酶基因的CYP68J5拷貝數(shù)對16α，17α-環(huán)氧黃體酮的轉(zhuǎn)化效率的影響。試驗表明多拷貝重組菌株在搖瓶條件下轉(zhuǎn)化率比現(xiàn)有生產(chǎn)菌株提高10％以上，