MBL高表達(dá)細(xì)胞株篩選及其產(chǎn)物生物學(xué)特性研究.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)是哺乳動(dòng)物C型凝集素超級(jí)家族中膠凝素家族成員，主要由肝細(xì)胞分泌，作為糖蛋白存在于血漿中。通過(guò)其糖識(shí)別域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)識(shí)別病原體表面糖結(jié)構(gòu)，通過(guò)其膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)與2個(gè)MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP-1，MASP-

2、2)結(jié)合，以不依賴抗體和C1q的凝集素途徑激活補(bǔ)體，發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能，還能與吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體結(jié)合而起直接調(diào)理作用。MBL的識(shí)別譜廣泛，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。MBL基因在人群中突變頻率極高，已知3個(gè)MBL結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變可導(dǎo)致MBL蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，與糖基配體和MASPs結(jié)合的能力降低，補(bǔ)體凝集素激活途徑幾乎完全消失，臨床上表現(xiàn)為各種病原體的急慢性反復(fù)感染。 人血漿MBL含量極低，從血漿中大量提取MBL用于科研和臨床

3、，花費(fèi)昂貴。通過(guò)基因工程、細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，體外大規(guī)模制備MBL，將為進(jìn)一步研究MBL，在免疫系統(tǒng)中的作用以及臨床上MBL缺損的治療提供條件。 本課題組曾成功構(gòu)建了兩個(gè)野生型MBL，真核表達(dá)載體，PcDNA3.1+-MBL和PcDNA4/HisMaxC-MBL，并用電穿孔法分別轉(zhuǎn)染入CHO、HEK293和HEPG2細(xì)胞，經(jīng)G418和Zeocin選擇轉(zhuǎn)染子并克隆化培養(yǎng)，獲得表達(dá)重組人MBL的細(xì)胞株。通過(guò)RT-PCR和ELISA等方法

4、分析比較，發(fā)現(xiàn)PcDNA3.1+-MBL在CHO和HEK293細(xì)胞中能夠大量合成RNA，其表達(dá)效率顯著高于其他載體和細(xì)胞的組合。因此，本研究采用本室保存的已轉(zhuǎn)染了PcDNA3.1+-MBL真核表達(dá)載體的CHO細(xì)胞株進(jìn)行為期2個(gè)月的篩選，通過(guò)ELISA技術(shù)篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞株，然后擴(kuò)大培養(yǎng)，分離純化其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究。 一、雙抗夾心ELISA體系的建立 用抗MBL-CRD單克隆抗體捕獲，辣根過(guò)

5、氧化物酶標(biāo)記的抗MBL-CLR多克隆抗體檢測(cè)，以丹麥Aarhus大學(xué)JensChr.Jensenius教授贈(zèng)送的重組人MBL蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白含量較高的細(xì)胞株，以獲得高表達(dá)重組人MBL蛋白的細(xì)胞克隆。該檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)0.1mg/L。 二、篩選穩(wěn)定高效表達(dá)重組人MBL蛋白的細(xì)胞株 本課題組已構(gòu)建了含PcDNA3.1+-MBL真核表達(dá)載體的CHO細(xì)胞。將其復(fù)蘇后，在96孔板中單克隆化，待細(xì)胞克隆

6、長(zhǎng)至孔底的1/4后，挑取細(xì)胞株置12孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后，以800mg/L的G418加壓篩選。隨后的1個(gè)月中，每隔3～5天換液一次，維持G418濃度為800mg/L。然后，通過(guò)雙抗夾心ELISA體系篩選得到6株高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株，其上清中目的蛋白濃度均在3mg/L以上。RT-PCR分析表明，這些轉(zhuǎn)染了MBL基因的CHO細(xì)胞能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄MBLmRNA。 三、重組人MBL蛋白的純化及其生物學(xué)特性研究 利用硫酸銨沉淀法初步純化表

7、達(dá)產(chǎn)物，鼠抗人MBL-CRDmAb親和層析柱進(jìn)一步純化，獲得重組人MBL蛋白。在1L培養(yǎng)上清中可獲得2mg左右目的蛋白。經(jīng)ELISA鑒定，純化后的蛋白產(chǎn)物可與抗MBL單克隆抗體、抗MBL-CRD單克隆抗體、抗MBL-CIR多克隆抗體結(jié)合。通過(guò)非還原SDS-PAGE和WesternBlot分析，重組人MBL分子量多集中在Mr200000以上，為三至六聚體形式。結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明所純化的重組MBL，蛋白能與甘露聚糖及重組MASP蛋白有效結(jié)合；C4