K562-imatinib耐藥細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)性狀的初步研究.pdf

1、研究目的： 1．體外建立K562/imatinib耐藥細(xì)胞株并對(duì)其生物學(xué)特性初步探討。 2．研究其可能的耐藥機(jī)制，為腫瘤耐藥的研究提供實(shí)驗(yàn)室條件。 研究方法： 1．K562耐藥細(xì)胞耐藥克隆建立：以伊馬替尼(imatinib)濃度梯度遞增法誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥。極限稀釋法克隆篩選，建立耐藥細(xì)胞株。 2．K562R的生物學(xué)特性分析：24孔板培養(yǎng)K562R和K562S，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。MTT法檢測(cè)不同

2、濃度組的伊馬替尼對(duì)K562S和K562R耐藥性。 3．K562R耐藥機(jī)制的初步分析：PCR．技術(shù)擴(kuò)增BCR-ABL融合基因及mdrl多藥耐藥基因。測(cè)序分析ABL酪氨酸激酶區(qū)有無點(diǎn)突變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P-gp表達(dá)。 研究結(jié)果： 1．KS62R的克隆純化和生物學(xué)特性分析 極限稀釋法成功克隆篩選出6株K562/imatinib純化細(xì)胞株，其能長(zhǎng)期存活于5μmol/L的伊馬替尼培養(yǎng)液中。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示5μmol

3、/L伊馬替尼作用于K562R細(xì)胞120h，活細(xì)胞數(shù)量與0h活細(xì)胞數(shù)量相比呈指數(shù)遞增。6個(gè)濃度梯度的伊馬替尼(0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0μmol/L)作用于K562S細(xì)胞24h，發(fā)現(xiàn)所有濃度(0濃度除外)伊馬替尼均可明顯抑制K562S細(xì)胞的生長(zhǎng)，24h細(xì)胞活力幾乎為零。 MTT法抑制率測(cè)定K562S細(xì)胞IC50為0.67±0.09μmol/L，K562R細(xì)胞約為10.17±0.85μmol/L，耐藥倍數(shù)約為15

4、倍，細(xì)胞耐藥性明顯增加，各耐藥細(xì)胞株間IC50無顯著性差異。 2.K562R耐藥機(jī)制的初步分析 巢式PCR檢測(cè)K562R.及K562S細(xì)胞株均有1579bp及863bp大小BCR.ABL融合基因表達(dá)，863bp目的基因序列測(cè)定未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變。 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一株耐藥細(xì)胞mdr1表達(dá)陽(yáng)性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其P-gp弱陽(yáng)性，兩者具有一致性。 結(jié)論： 1.體外成功建立K562/imatinib耐藥細(xì)胞