誘導耐藥K562-ADM和轉(zhuǎn)基因耐藥K562-MDR細胞株的生物學行為和耐藥機制的比較研究.pdf

1、目的:該研究以慢性髓細胞白血病急性紅白變細胞系K562,相應(yīng)的阿霉素耐藥細胞株K562/ADM和轉(zhuǎn)mdr1基因的K562/MDR耐藥細胞株為研究對象,旨在比較三種細胞系的生物學特性及后兩者耐藥機制的異同.探討K562/MDR細胞株作為單機制耐藥模型的可行性,為進一步研究腫瘤耐藥及其逆轉(zhuǎn)奠定基礎(chǔ).方法:實驗分為三部分:(1)觀察K562、K562/ADM和K562/MDR三種細胞系的生物學行為.在光學和電子顯微鏡下分別對三種細胞系的形態(tài)學

2、進行觀察;同時測定三種細胞系的群體倍增時間;應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測三種細胞系的細胞周期時相分布;計數(shù)三種細胞系的染色體數(shù)目;來觀察藥物誘導和基因轉(zhuǎn)移是否對細胞的生物學行為造成影響.(2)以K562細胞為對照,比較K562/ADM和K562/MDR兩種細胞株的耐藥性并應(yīng)用三氧化二砷(As<,2>O<,3>)對其進行初步逆轉(zhuǎn).MTT法分別測定三種細胞系對As<,2>O<,3>和IC<,50>和低毒劑量,三種細胞系對阿霉素(ADM)、柔紅霉素(D

3、NR)和長春新堿(VCR)和IC<,50>和加入低毒劑量的As<,2>O<,3>后的IC<,50>,比較K562/ADM和K562/MDR兩者的耐藥性、耐藥譜和As<,2>O<,3>的逆轉(zhuǎn)效果.(3)與多藥耐藥相關(guān)的基因與蛋白的檢測.免疫細胞化學法檢測mdr1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST-π)基因編碼的GST-π的表達變化,并用計算機圖像分析系統(tǒng)對GST-π進行半定量分析,流式細胞術(shù)定量檢測P-gp、bc

4、l-2的表達;生化法測定細胞內(nèi)GSTs和拓撲異構(gòu)酶(topoⅡ)活性的變化;RT-PCR法檢測topoⅡmRNA水平的表達變化;以比較K562/ADM和K562/MDR兩種細胞株耐藥機制在分子水平上的差異.結(jié)論:1.與對比療藥物敏感的細胞系K562相比,K562/MDR形態(tài)和增殖特性與K562相似;K562/ADM的增殖減慢,遺傳物質(zhì)染色體的數(shù)目也發(fā)生了改變.說明化療藥物的誘導對細胞產(chǎn)生了損傷.2.K562/ADM和K562/MDR對A

5、s<,2>O<,3>不具耐藥性,K562/ADM對As<,2>O<,3>的敏感性強于K562和K562/MDR;K562/ADM的藥物耐受程度高于K562/MDR,但二者有較為一致的交叉耐藥譜,低毒劑量的As<,2>O<,3>可逆轉(zhuǎn)兩細胞的耐藥.3.與K562比較,K562/ADM細胞中P-gp、GSP-π呈過表達,bcl-2表達增高,topoⅡ的編碼基因發(fā)生點突變;而K562/MDR細胞中除轉(zhuǎn)導基因mdr1編碼的P-gp表達較K562