大黃素衍生物對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562及其伊馬替尼耐藥株K562-G01的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：設(shè)計(jì)合成10種大黃素衍生物,從中篩選出抑制白血病細(xì)胞增殖作用較強(qiáng)的衍生物;研究大黃素衍生物對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562及其耐伊馬替尼細(xì)胞株K562/G01增殖、凋亡的影響;觀察大黃素衍生物對K562、K562/G01細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;觀察大黃素衍生物對P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號通路的作用。
　　方法：

2、以大黃素為母體合成10種大黃素衍生物,用MTT法檢測各種大黃素衍生物對白血病細(xì)胞株增殖的影響。細(xì)胞株包括P210Bcr-Abl表達(dá)陽性的CML細(xì)胞株K562細(xì)胞、耐ADM的KAR細(xì)胞、耐IM的K562/G01細(xì)胞。從中篩選出大黃素衍生物E19進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT比色法及細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察大黃素衍生物E19對K562、K562/G01細(xì)胞增殖的影響;DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察衍生物作用后的細(xì)胞形態(tài)變化;DNA片段化檢測大黃素衍生物E19

3、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用;蛋白印跡法(Western blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、c-Myc、procaspase-9、cleaved Caspase-3、PARP,并檢測P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游信號通路的PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號分子的變化。
　　結(jié)果：1、MTT結(jié)果顯示,各種大黃素衍生物對K562細(xì)胞、KAR細(xì)胞及K562/G01細(xì)胞的增殖抑

4、制作用不同,大部分大黃素衍生物對KAR細(xì)胞沒有明顯的增殖抑制作用,而對K562細(xì)胞、K562/G01細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制增殖作用。從中篩選出抑制作用較強(qiáng)的衍生物E19進(jìn)行研究。
　　2、MTT法顯示大黃素衍生物E19作用K562、K562/G01細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.1966±0.1949μmol/L和1.2157±0.1642μmol/L,兩者相接近,并呈時間及劑量依賴方式抑制K562細(xì)胞、K562/G01細(xì)

5、胞的增殖。
　　3、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)均顯示大黃素衍生物E19能明顯抑制兩種細(xì)胞集落的形成,并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
　　4、DAPI染色后在熒光顯微鏡下能看到E19作用后K562、K562/G01細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;DNA片段化檢測可觀察到DNA凋亡梯帶。
　　5、Western blot結(jié)果顯示,大黃素衍生物E19作用K562、K562/G01細(xì)胞后,Bcl-2、c-Myc、PARP、Caspase-9

6、、P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl、p-MAPK、p-AKT、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p-P70表達(dá)均下調(diào),cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào),P70、AKT、MAPK、mTOR的表達(dá)變化趨勢不明顯,調(diào)節(jié)方式呈時間和濃度依賴性。
　　結(jié)論：在合成的10種大黃素衍生物中,E19對K562、K562/G01細(xì)胞有明顯的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用,這一過程中,P210Bcr-Abl、p-P210