大黃素衍生物對慢性粒細胞白血病細胞株K562及其伊馬替尼耐藥株K562-G01的作用及機制研究.pdf

1、目的：設計合成10種大黃素衍生物,從中篩選出抑制白血病細胞增殖作用較強的衍生物;研究大黃素衍生物對慢性粒細胞白血病細胞株K562及其耐伊馬替尼細胞株K562/G01增殖、凋亡的影響;觀察大黃素衍生物對K562、K562/G01細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響;觀察大黃素衍生物對P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號通路的作用。
　　方法：

2、以大黃素為母體合成10種大黃素衍生物,用MTT法檢測各種大黃素衍生物對白血病細胞株增殖的影響。細胞株包括P210Bcr-Abl表達陽性的CML細胞株K562細胞、耐ADM的KAR細胞、耐IM的K562/G01細胞。從中篩選出大黃素衍生物E19進行實驗。MTT比色法及細胞集落形成實驗觀察大黃素衍生物E19對K562、K562/G01細胞增殖的影響;DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察衍生物作用后的細胞形態(tài)變化;DNA片段化檢測大黃素衍生物E19

3、誘導細胞凋亡的作用;蛋白印跡法(Western blot)檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、c-Myc、procaspase-9、cleaved Caspase-3、PARP,并檢測P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游信號通路的PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號分子的變化。
　　結果：1、MTT結果顯示,各種大黃素衍生物對K562細胞、KAR細胞及K562/G01細胞的增殖抑

4、制作用不同,大部分大黃素衍生物對KAR細胞沒有明顯的增殖抑制作用,而對K562細胞、K562/G01細胞有較強的抑制增殖作用。從中篩選出抑制作用較強的衍生物E19進行研究。
　　2、MTT法顯示大黃素衍生物E19作用K562、K562/G01細胞48h的半數抑制濃度(IC50)分別為1.1966±0.1949μmol/L和1.2157±0.1642μmol/L,兩者相接近,并呈時間及劑量依賴方式抑制K562細胞、K562/G01細

5、胞的增殖。
　　3、細胞集落形成實驗均顯示大黃素衍生物E19能明顯抑制兩種細胞集落的形成,并在一定范圍內呈濃度依賴性。
　　4、DAPI染色后在熒光顯微鏡下能看到E19作用后K562、K562/G01細胞出現典型的凋亡形態(tài)學改變;DNA片段化檢測可觀察到DNA凋亡梯帶。
　　5、Western blot結果顯示,大黃素衍生物E19作用K562、K562/G01細胞后,Bcl-2、c-Myc、PARP、Caspase-9

6、、P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl、p-MAPK、p-AKT、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p-P70表達均下調,cleaved Caspase-3表達上調,P70、AKT、MAPK、mTOR的表達變化趨勢不明顯,調節(jié)方式呈時間和濃度依賴性。
　　結論：在合成的10種大黃素衍生物中,E19對K562、K562/G01細胞有明顯的抑制增殖、誘導凋亡的作用,這一過程中,P210Bcr-Abl、p-P210