抗乙型肝炎病毒的小干擾RNA靶位點(diǎn)篩選平臺(tái)的建立.pdf

1、第一部分抗乙型肝炎病毒S基因的小干擾RNA靶位點(diǎn)篩選體系的建立 目的:針對(duì)乙型肝炎病毒S基因(HepatitisBvirussgene，HBs)序列制備兩種小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，載體法構(gòu)建3個(gè)小發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表達(dá)載體和化學(xué)合成法制備一個(gè)siRNA分子，同時(shí)構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和HBs基因融合表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，在

2、mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)兩種siRNA對(duì)HBs基因表達(dá)的抑制作用，篩選出最有效抑制HBs的siRNA作用靶位點(diǎn)。 方法:抽提HepG2.2.15細(xì)胞基因組，用PCR法獲取HBs基因片段，克隆在增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N3上，構(gòu)建成pHBs-EGFP融合蛋白表達(dá)載體；利用psiRNA-hHlneo質(zhì)粒，構(gòu)建針對(duì)HBs基因的shRNA表達(dá)載體psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3；化學(xué)合成小干擾RNAsiR

3、NA-HBs，共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR儀檢測(cè)siRNA對(duì)HBs基因mRNA表達(dá)的抑制作用，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)shRNA對(duì)融合蛋白表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果:成功構(gòu)建shRNA表達(dá)載體和pHBs-EGFP表達(dá)載體，shRNA表達(dá)載體和化學(xué)合成的siRNA均可不同程度地抑制HBs基因的表達(dá)，其中載體psiRNA1對(duì)HBs基因的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)HBsmRNA抑制率達(dá)78.77％，對(duì)融合蛋白HBs-

4、EGFP的抑制率為61.94％；化學(xué)合成的siRNA在50nM時(shí)抑制作用最大，對(duì)HBsmRNA抑制率達(dá)61.30％，對(duì)融合蛋白HBs-EGFP的抑制率為48.73％。 結(jié)論:篩選出抑制HBs基因作用最強(qiáng)的的siRNA靶位點(diǎn)，位于ayw亞型HBV基因組161nt～181nt，成功地建立了一個(gè)行之有效、相對(duì)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便且便于長(zhǎng)期研究的RNA干擾研究體系，為以后的抗HBV治療和RNA干擾相關(guān)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。 第二

5、部分抗乙型肝炎病毒X基因的小干擾RNA靶位點(diǎn)篩選體系的建立 目的:針對(duì)乙型肝炎病毒X基因(HepatitisBvirusXgene，HBx)序列制備兩種siRNA，載體法構(gòu)建3個(gè)shRNA表達(dá)載體和化學(xué)合成法制備一個(gè)siRNA分子，同時(shí)構(gòu)建HBx表達(dá)載體pHBx，共轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)兩種siRNA對(duì)X基因表達(dá)的抑制作用，篩選出最有效抑制該基因的靶位點(diǎn)。 方法:抽提HepG2.2.15細(xì)

6、胞基因組，用PCR法獲取HBx基因片段，克隆在真核表達(dá)載體pCDNA3上，構(gòu)建成pHBx表達(dá)載體；利用psiRNA-hH1neo質(zhì)粒，構(gòu)建針對(duì)HBx基因的shRNA表達(dá)載體psiRNA4、psiRNA5、psiRNA6，化學(xué)合成小干擾RNAsiRNA-HBx，共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR儀檢測(cè)siRNA對(duì)HBx基因mRNA表達(dá)的抑制作用，用免疫印跡法(WesternBlot)檢測(cè)siRNA對(duì)HBx蛋白表達(dá)的抑

7、制作用。結(jié)果成功構(gòu)建shRNA表達(dá)載體和pHBx表達(dá)載體，shRNA表達(dá)載體和化學(xué)合成的siRNA均可不同程度地抑制HBx基因的表達(dá)，其中shRNA載體psiRNA4對(duì)HBx基因的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)HBxmRNA抑制率達(dá)80.27％，對(duì)HBx蛋白的抑制率為65.59％；化學(xué)合成的siRNA在50nM時(shí)抑制作用最大，對(duì)HBxmRNA抑制率達(dá)56.38％，對(duì)HBx蛋白的抑制率為56.53％。 結(jié)論:篩選出抑制作用最強(qiáng)的HBx基因的si

8、RNA靶位點(diǎn)，位于ayw亞型HBV基因組1764nt～1784nt，載體法和化學(xué)合成法siRNA都能有效封閉HBx基因的表達(dá)，這對(duì)控制HBV感染和預(yù)防HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生都有十分重大的意義。 第三部分shRNA在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的抗HBV活性 目的：RNAi技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著抑制HBs基因和HBx基因的表達(dá)，如果在HBV整體的復(fù)制水平上也能夠起到明顯的抑制作用，則該技術(shù)在治療HBV感染

9、和防治HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌方面將有更廣闊的應(yīng)用的前景。 方法：HepG2.2.15細(xì)胞系是由頭尾相接的HBVayw亞型基因組轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2而建立的一株能穩(wěn)定分泌HBV各種抗原和完整病毒顆粒的細(xì)胞系。因而用HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾的抗病毒研究更接近于疾病的治療過(guò)程。因此，把上述兩部份篩選的載體法siRNApsiRNA1和psiRNA4分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定培養(yǎng)上清中HBV

10、DNA水平的變化，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的變化。 結(jié)果：初步結(jié)果表明，通過(guò)內(nèi)源性傳遞產(chǎn)生的siRNA能夠明顯地抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV的復(fù)制。psiRNA1能抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清68％的HBsAg和25.4％的HBeAg，對(duì)培養(yǎng)上清中HBVDNA的抑制率達(dá)52.7％。而psiRNA4能抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清79％的HBsAg和88.7％的HBeA