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文檔簡(jiǎn)介
1、實(shí)驗(yàn)背景及目的 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),又稱成血管細(xì)胞,存在于骨髓(bone marrow,BM)、臍帶血(umbilical cord blood,UCB)及外周血(peripheral blood,PB)中,可以分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,Ecs),是血管Ecs 的前體細(xì)胞。研究表明,EPCs 不僅參與胚胎時(shí)期血管生成,而且在缺血、血管損
2、傷等刺激下,可動(dòng)員并遷移至病變局部參與出生后的血管發(fā)生及受損內(nèi)皮的修復(fù),在缺血組織的血運(yùn)重建方面發(fā)揮著重要作用,給缺血性疾病的治療帶來(lái)了新的希望。但對(duì)EPCs 的生物學(xué)特性及其影響因素尚缺乏全面了解,而這是對(duì)于更好的應(yīng)用EPCs 為人類造福所必需的。 最新的研究發(fā)現(xiàn),EPCs的數(shù)量、功能等生物學(xué)特性與心血管疾病的危險(xiǎn)因素如高脂血癥、糖尿病、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)等成負(fù)相關(guān)。血管緊張素II(A
3、ngII)是一種與多種心血管疾病的病理生理過(guò)程密切相關(guān)的致病因素,它的水平是否也會(huì)影響EPCs的生物學(xué)特性尚不清楚。另一方面,近些年不斷有研究報(bào)道AngII可以促進(jìn)新生血管的形成,提示它可能與EPCs存在一定的相互關(guān)系。 AngII可以促進(jìn)Ecs的增殖,抑制凋亡,上調(diào)其粘附分子的表達(dá),增加其內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA的合成,從而增加一氧化氮(nitr
4、ic oxide,NO)的分泌。因此,我們假設(shè)AngII對(duì)EPCs也具有類似作用。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)大鼠BM-EPCs的基礎(chǔ)上,觀察一定濃度的AngII對(duì)其增殖、凋亡、NO分泌及粘附能力等生物學(xué)特性的影響,并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制,以期為臨床更好地利用EPCs治療缺血性疾病提供思路。 實(shí)驗(yàn)方法 第一部分:大鼠BM-EPCs 的體外分離、誘導(dǎo)分化及鑒定。無(wú)菌分離大鼠股骨及脛骨,沖洗骨髓腔,收集細(xì)胞懸液,利用Ficoll 密度梯
5、度離心法分離BM 單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs),接種在含有特定濃度血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。 對(duì)原代細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD133 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2 型受體(vascularendothelial grow
6、th factor type 2 receptor,VEGFR-2/Flk-1)進(jìn)行雙染,激光共聚焦鑒定,雙陽(yáng)性為EPCs。 第二部分:AngII 對(duì)BM-EPCs 增殖能力的影響及機(jī)制探討。取原代培養(yǎng)的EPCs,分成若干組,在其培養(yǎng)基中添加不同濃度的AngII,至培養(yǎng)終點(diǎn),四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse trans
7、cription-polymerase chain raction,RT-PCR)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的Flk-1 mRNA 進(jìn)行擴(kuò)增,半定量分析其表達(dá)量的差異。 第三部分:AngII 對(duì)BM-EPCs 凋亡、NO 分泌及粘附能力的影響。取原代培養(yǎng)的EPCs,不同濃度的AngII 干預(yù)后,Hoechst 染色測(cè)定凋亡率,試劑盒測(cè)定NO 分泌量,結(jié)晶紫染色測(cè)定粘附能力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、體外成功培養(yǎng)出大鼠BM-EPCs,并經(jīng)
8、鑒定證實(shí)。 2、與空白對(duì)照組比較,在VEGF 存在的前提下,不同濃度的AngII 可以使EPCs 的增殖活性增強(qiáng)(P<0.05),且呈濃度依賴性;AngII 可以促進(jìn)EPCsFlk-1 mRNA 的表達(dá)。血管緊張素II 1 型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)拮抗劑纈沙坦、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑均可以拮抗這種作用(P<0.05)。 3、與空
9、白對(duì)照組比較,不同濃度的AngII可以使無(wú)血清條件下EPCs的凋亡率下降(P<0.05);不同濃度的AngII可以使EPCs NO的分泌量增加(P<0.05);不同濃度的AngII可以使短期內(nèi)EPCs的貼壁細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05)。作用均呈濃度依賴性,纈沙坦可拮抗AngII的上述作用(P<0.05)。 結(jié)論 一定濃度的AngII可以改善BM-EPCs的生物學(xué)特性,表現(xiàn)為細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)、凋亡率下降、NO分泌量增加、粘
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