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文檔簡介
1、目的:利用RNA干擾(RNAi)技術,特異性沉默Prohibitin(PHB)基因的表達,研究PHB基因對大腸癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的調節(jié)作用,為運用RNAi技術治療大腸癌的可行性奠定理論和實驗基礎。
方法:以Western blot檢測PHB在多株大腸癌細胞株中表達,篩選出高表達PHB蛋白細胞株,以該株細胞為研究對象,在生長狀態(tài)良好情況下瞬時轉染針對靶基因PHB設計的siRNA三個特異性片段PHB138、PHB173
2、、PHB539,以脂質體Lipofectamine2000為載體,轉染所篩選出的大腸癌細胞株,72小時后,通過比較基因沉默后蛋白的表達,篩選出干擾效果最明顯的兩個片段,設立陰性對照和篩選出的兩個siRNA片段為實驗組,重新轉染該株大腸癌細胞,抑制靶基因PHB表達,通過CCK-8檢測、平板克隆形成實驗、軟瓊脂克隆形成實驗等槍測細胞增殖能力。在奧沙利鉑藥物誘導基礎上,通過PI和RNase流式檢測細胞周期;Annexin V-FITC細咆凋亡
3、試劑流式細胞術、Caspase-3/Caspase-9活性檢測等方法檢測細胞凋亡;Annexin V-FITC試劑和Hoechst染色熒光顯微鏡觀察,記錄細胞典型凋亡形態(tài)和細胞核改變。
結果:Western blot結果顯示PHB蛋白在七株大腸癌細胞中均有表達,且在HCT116中表達最高。靶向PHB特異性RNAi化學合成片段,瞬時轉染HCT116后,三個片段均明顯抑制蛋白表達,且片段PHB138、PHB539抑制效果更好。
4、細胞增殖能力檢測結果,CCK-8法繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)轉染siRNA沉默PHB基因后可抑制HCT116細胞的生長;通過平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗檢測PHB對細胞體外成瘤能力的影響,發(fā)現(xiàn)轉染后HCT116細胞克隆數(shù)量少于陰性對照組,平板克隆形成率分別為NC(43.4士2.11)%、PHB138(31.1±3.05)%、PHB539(12.4±1.26)%;軟瓊脂克隆形成率NC(8.03±0.912)‰、PHB138(4.22±0.569
5、)‰、PHB539(2.82±0.621)‰,且干擾組與NC對照差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過細胞周期分析,發(fā)現(xiàn)轉染沉默HCT116細胞后S期細胞比例下降,凋亡峰升高,S期比例NC(47.7士8.75)%、PHB138(33.4士0.510)%、PHB539(31.7士1.91)%;應用Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒流式檢測也同樣發(fā)現(xiàn)D2區(qū)顯示凋亡細胞比例增加,有統(tǒng)計意義(P<0.05);Caspase-3活性度PH
6、B138(1.50士0.392)、PHB539(1.81士0.416), Caspase-9活性度PHB138(2.02士0.435)、PHB539(2.81士0.517)。Annexin V-FITC和Hoechst染色均在熒光顯微鏡下觀測有明顯的凋亡現(xiàn)象,且凋亡比例和強度比陰性對照強。
結論:靶向PHB-siRNA干擾可以有效的沉默大腸癌細胞PHB基因,下調PHB蛋白水平,從而抑制大腸癌細胞增殖、促進大腸癌細胞凋亡;實
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