RNA干擾沉默Sp1基因?qū)Υ竽c癌SW620細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、研究背景： 大腸癌(Colorectal cancer)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生存的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在西方國(guó)家惡性腫瘤的發(fā)病率中居第2位，在我國(guó)居常見(jiàn)惡性腫瘤第4位。大腸癌總的5年存活率較低，因此早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷與治療大腸癌是提高生存率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的治療方法對(duì)腫瘤特異性和敏感性差，副作用大，效果欠佳，近年來(lái)，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究取得了突破性進(jìn)展，因此探尋大腸癌的基因治療已成為目前研究的熱點(diǎn)。

2、 轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白1(Sp1)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤組織和細(xì)胞中的異常表達(dá)和活化，可通過(guò)促進(jìn)腫瘤相關(guān)生長(zhǎng)因子和血管生成基因表達(dá)等機(jī)制，營(yíng)造適宜腫瘤生長(zhǎng)的局部微環(huán)境，正向調(diào)節(jié)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移潛能和血管生成。目前研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的異常表達(dá)與肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、及其預(yù)后密切相關(guān)。但Sp1基因在大腸癌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其分子機(jī)制等研究工作國(guó)內(nèi)尚無(wú)開(kāi)展。因此探討大腸癌中Sp1基因的表達(dá)及其對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為

3、的影響，將有助于進(jìn)一步明確Sp1基因在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制，為大腸癌的預(yù)防和治療提供切入點(diǎn)，在大腸癌的基因治療方面有較大的應(yīng)用前景。 目的： 1．構(gòu)建針對(duì)Sp1基因的RNA干擾真核表達(dá)載體，觀察其對(duì)大腸癌SW620細(xì)胞Sp1基因表達(dá)及活性的抑制作用。 2．探討Sp1基因沉默后對(duì)大腸癌SW620細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)基因的表達(dá)改變情況，初步分析其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。 方法： 1．設(shè)

4、計(jì)合成針對(duì)Sp1基因的有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列，退火后克隆到RNA干擾表達(dá)載體pGenesil-1質(zhì)粒上，構(gòu)建pGenesil-1-Sp1(+)和pGenesil-1-Sp1(-)重組質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序分析；脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，提取總RNA及蛋白質(zhì)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)其對(duì)Sp1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，凝膠遷移率變動(dòng)分析(EMSA)檢測(cè)Sp1活性的變化。 2．采

5、用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察Sp1下調(diào)后對(duì)SW620細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡和細(xì)胞遷移能力等生物學(xué)行為的影響。 3．脂質(zhì)體介導(dǎo)pGenesil-1-Sp1(+)及pGenesil-1-Sp1(-)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Sp1沉默對(duì)VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，EMSA檢測(cè)Sp1與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合活性的變

6、化； 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建針對(duì)Sp1基因的RNA干擾真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后可以抑制Sp1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。pGenesil-1-Sp1(+)-SW620組Sp1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在24h、48h、72h分別為0.549±0.034、0.311+0.075、0.406±0.041，抑制率分別約為42.44％、68.47％、57.70％；Spl蛋白抑制率在48h約為56.82％； EMSA結(jié)果顯示Sp

7、1的活性明顯下降，統(tǒng)計(jì)分析表明，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示轉(zhuǎn)染Sp1干擾質(zhì)?？梢杂行У匾种芐W620細(xì)胞中Sp1的表達(dá)及活性。 2．生長(zhǎng)曲線、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Sp1干擾質(zhì)粒后SW620細(xì)胞增殖遷移能力受到明顯抑制，細(xì)胞周期表現(xiàn)為干擾實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例為(67.47±2.51)％，而SW620空白組和陰性對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例分別為(42.19±2.13)％、(48.52±

8、1.86)％1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率約為22.54％。而陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率約為4.31％，兩組有顯著差異(P＜0.05)。 3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pGenesil-1-Sp1(+)質(zhì)粒后，SW620細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，EMSA結(jié)果顯示Sp1基因沉默可低其與VEGF的結(jié)合活性。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建針對(duì)Sp1基因的RNA干擾質(zhì)粒，并證實(shí)其在大腸