VEGF對耐藥白血病細胞生物學特性的影響.pdf

1、目的：1．觀察人慢性髓性白血病細胞系敏感株K562細胞和耐藥株K562/A02細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因及蛋白的表達情況；并構(gòu)建針對人VEGF的特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾片段，通過脂質(zhì)體2000將VEGFshRNA導入白血病耐藥株K562/A02細胞，觀察轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后耐藥白血病細胞VEGF基因及蛋白表達的變化。2．觀察白血病細胞VEGF下調(diào)后，耐藥白血病細胞的生物學行為的變化，探討VEGFshRNA對

2、K562/A02細胞生物學行為的影響及其機制，并觀察PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路在此過程中的作用。 方法：1．采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測K562細胞和耐藥株K562/A02細胞VEGF基因的表達情況，Westernblotting法檢測兩株細胞VEGF蛋白的表達差異；并采用脂質(zhì)體2000介導的方法將針對人VEGF基因的三個特異性shRNA及隨機片段HK(VEGFshRNA1、VEGFshRNA2

3、、VEGFshRNA、HK)轉(zhuǎn)染入K562/A02細胞，采用RT-PCR和Westernblotting法分別檢測轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后的這四組細胞和K562/A02細胞VEGFmRNA和蛋白的表達情況，選取對VEGF基因干擾效果佳的時間點進行后續(xù)實驗，以未轉(zhuǎn)染組(K562/A02)及轉(zhuǎn)染隨機片段組(HK)為對照組。 2．采用苔盼蘭拒染細胞直接計數(shù)法、四唑藍比色法(MTT)和細胞周期測定分析VEGFshRNA對K562/A

4、02細胞增殖的影響，AnnexinV檢測轉(zhuǎn)染前后白血病細胞的凋亡情況，采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后阿霉素對耐藥白血病細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)的變化，計算其增敏倍數(shù)，RT—PCR、流式細胞術(shù)和Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染前后白血病細胞耐藥相關(guān)基因(MDR1、MRP1、topoⅡ)及其蛋白的表達變化，采用胞內(nèi)羅丹明123(Rho123)潴留試驗檢測轉(zhuǎn)染前后白血病細胞跨膜轉(zhuǎn)運蛋白P—gp及MRP1的功能狀態(tài)，采用免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染

5、前后白血病細胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信號傳導通路的活化水平。 結(jié)果：1．與敏感株K562細胞比較，耐藥株K562/A02細胞VEGF基因的表達水平更高，兩組細胞VEGFmRNA與β—actin的灰度比值分別為0.518±0.055、0.814±0.073(t=6.845，p＜0.001)，具有顯著的統(tǒng)計學差異；并且免疫印跡法顯示類似的結(jié)果，K562/A02細胞VEGF蛋白的表達水平顯著高于K562細胞。通過脂質(zhì)體介導

6、的方法將隨機片段HK和VEGFshRNA轉(zhuǎn)染入K562/A02細胞，共獲5組細胞，依次為K562/A02、K562/A02-HK、K562/A02-VEGFshRNA1、K562/A02-VEGFshRNA2和K562/A02-VEGFshRNA3；轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后，RT—PCR結(jié)果顯示：不同時間點隨機片段HK組和未轉(zhuǎn)染組細胞VEGFmRNA的表達均無差異，而轉(zhuǎn)染VEGFshRNA的各組細胞VEGFmRNA的表達水平均低于H

7、K組，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較均有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，并且轉(zhuǎn)染不同時間VEGFshRNA3對VEGF的抑制率分別為(29.6±1.1)％、(45.9±1.6)％和(43.2±1.5)％；Westernblotting結(jié)果也顯示：轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后，陽性轉(zhuǎn)染組VEGF的蛋白條帶強度均比未轉(zhuǎn)染組和HK組減弱，其中以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組最明顯，與PCR結(jié)果基本一致。說明VEGFs

8、hRNA的導入有效地抑制了目的基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達，并且以VEGFshRNA3的干擾效果最明顯。 2．細胞生長曲線提示，與對照組比較，陽性轉(zhuǎn)染組細胞生長緩慢，細胞周期動力學分析顯示陽性轉(zhuǎn)染組G1期細胞增多，G2期與S期細胞顯著減少(p＜0.05)，提示VEGF的表達可能參與細胞增殖的調(diào)節(jié)。在小劑量As2O3作用下，未轉(zhuǎn)染組無明顯凋亡，HK組與陽性轉(zhuǎn)染組細胞均出現(xiàn)凋亡，AnnexinV檢測結(jié)果顯示：陽性轉(zhuǎn)染組細胞的早期凋亡數(shù)量高

9、于HK組和未轉(zhuǎn)染組細胞，5組細胞的凋亡細胞率依次為(1.52±0.56)％、(9.14±0.98)％、(11.09±1.47)％(t=2.206，p=0.07)、(19.89±1.63)％(t=11.29，p＜0.001)和(32.30±2.16)％(t=19.527，p＜0.001)，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明VEGFshRNA的導入可能部分地抑制了藥物對耐藥白血病細胞的誘導

10、凋亡作用。MTT結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組的阿霉素IC50值明顯低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，各組細胞的IC50值分別為19.23±1.633、18.66±1.632、17.67±1.425(t=0.982，p=0.364)、16.11±1.184(t=2.553，p=0.043)及11.46±1.061(t=7.394，p＜0.001)，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較差異有統(tǒng)計學意義。RT—PCR結(jié)果顯示：與HK組及

11、未轉(zhuǎn)染組比較，陽性轉(zhuǎn)染組耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1、topoⅡmRNA的表達水平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，并且均以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組下調(diào)最顯著，差異有統(tǒng)計學意義；Westernblotting結(jié)果顯示：陽性轉(zhuǎn)染組MRP1蛋白和topoⅡ蛋白表達水平均低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，且均以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組下調(diào)最顯著；流式細胞儀顯示：5組細胞P—gp的平均熒光強度分別為68.44±2.08、67.59±1.82、61.20±1.47

12、(t=5.463，p=0.002)、58.03±1.63(t=7.823，p＜0.001)、40.72±1.22(t=24.51，p＜0.001)，陽性轉(zhuǎn)染組P—gp的表達量均明顯低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，具有統(tǒng)計學差異；說明VEGF可能調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1、topoⅡ的轉(zhuǎn)錄及翻譯。胞內(nèi)Rho123潴留試驗顯示：5組細胞羅丹明123的平均熒光強度分別為11.823±1.611、11.784±1.633、15.683±1.633

13、(t=3.377，p=0.015)、16.158±1.45(t=3.613，p=0.011)、699.294±73.485(t=18.707，p＜0.001)(n=4)，各陽性轉(zhuǎn)染組與HK組比較有顯著的統(tǒng)計學差異，說明VEGFshRNA的導入可能抑制P—gp及MRP1的外排功能，從而增加細胞內(nèi)藥物的濃度；Westernblotting結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組P—ERK和P—AKT的表達強度明顯低于HK組及未轉(zhuǎn)染組，顯示VEGFshRNA的導入

14、可以抑制ERK和AKT的磷酸化水平，從而影響其下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 結(jié)論：耐藥株K562/A02細胞VEGF基因和蛋白的表達水平明顯高于其敏感株K562細胞，轉(zhuǎn)染VEGF特異性shRNA能下調(diào)K562/A02細胞VEGF基因與蛋白的表達，減慢細胞生長，促進細胞凋亡，VEGFshRNA的導入使耐藥白血病細胞對阿霉素的敏感性增加，某些耐藥相關(guān)基因如MDR1、MRP1、topoⅡ表達的下調(diào)，可以使PI3K/AKT和MAPK/ERK信