胭脂魚CD79a和CD79b基因的克隆、表達及功能分析.pdf

1、胭脂魚（ Myxocyprinus asiaticus）屬鯉形目（ Cypriniformes）胭脂魚科（Catostomidae），僅分布于我國長江和閩江，為我國也是亞洲特有的物種。同時，其肉質鮮美，在水產養(yǎng)殖上具有重要的經濟價值。近年來，由于環(huán)境的破環(huán)、過度捕撈，加之性成熟較晚，胭脂魚的數(shù)量逐漸減少，現(xiàn)已被列為我國國家二級水生野生保護動物。人工養(yǎng)殖是恢復胭脂魚資源的重要途徑，但在養(yǎng)殖過程中死亡率卻居高不下。目前，對該問題的研究還停留

2、在人工水質、投喂飼料、病原體感染等對其高死亡率的影響。本研究試圖從其免疫系統(tǒng)基礎研究入手，希望為解決胭脂魚人工繁殖中所存在的問題及疾病預防提供理論依據(jù)。
　　適應性免疫系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵的重要機制，研究表明：魚類是最早具有適應性免疫系統(tǒng)的低等脊椎動物，在免疫系統(tǒng)進化研究中占有特殊地位。因此，對魚類免疫系統(tǒng)的研究能為脊椎動物免疫系統(tǒng)的進化規(guī)律提供一定的理論基礎。在免疫系統(tǒng)中，B淋巴細胞介導的體液免疫通過漿細胞產生抗體來消滅抗原

3、，位于B細胞表面的抗原受體輔助分子CD79a和CD79b在抗原刺激信號的轉導過程中發(fā)揮重要作用。此外，CD79a蛋白存在于B細胞的整個生命歷程且不存在于其它健康細胞，故被視為B細胞的標志分子。然而，目前關于B細胞抗原受體輔助分子在硬骨魚類中的研究甚少，僅在斑點叉尾鮰和石斑魚中有相關報道。
　　本文通過同源比對和cDNA末端快速擴增的方法，獲得胭脂魚B細胞抗原受體輔助分子CD79a和CD79b序列。其中CD79a的cDNA全長105

4、9 bp，5’非編碼區(qū)包含33 bp，3’非編碼區(qū)包含348 bp含有加尾信號（AATAAA），開放閱讀框包含678 bp編碼225個氨基酸。CD79b的cDNA長為801 bp，5’非編碼區(qū)包含165 bp，開放閱讀框包含636 bp編碼211個氨基酸。多序列比對結果表明兩者均由信號肽、免疫球蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和富含酪氨酸活化基序胞的質區(qū)組成，同時，用于形成域內二硫鍵的半胱氨酸殘基也非常保守。進化樹結果顯示胭脂魚的CD79a和CD79b

5、分別與斑馬魚和鯉魚的CD79a和CD79b聚為一枝。
　　發(fā)育時期RT-PCR結果表明：CD79a和CD79b在胭脂魚的受精卵中即可檢測到，但表達量極其微弱，至出膜后30天左右的時候，CD79a和CD79b表達量趨于穩(wěn)定并逐漸增多。各組織RT-PCR結果表明：CD79a和CD79b在脾臟中表達量最高，頭腎、腎和外周血次之，心臟、鰓和肝中表達量較少，在腸、腦、皮膚和肌肉中未檢測到表達。滅活嗜水氣單胞菌刺激胭脂魚后，Q-PCR結果表明

6、：CD79a和CD79b在頭腎中的變化最顯著，在所有時間點都檢測到有上升趨勢，其中在48 h、72 h、96 h和7 d時表達水平顯著升高（P＜0.05﹚。在脾臟中的變化趨勢較頭腎弱，CD79a和CD79b的表達量主要在48 h、72 h和96 h檢測到上調。在腎中的變化最弱，CD79a和CD79b主要在48 h、72 h、96 h和7 d檢測到有微弱的上調。
　　對外周血白細胞，脾臟、頭腎、腎、腸道、鰓和皮膚組織切片的原位雜交結

7、果顯示：少量CD79a，CD79b和IgM陽性細胞在外周血中細胞可以檢測到。在脾臟、頭腎和腎中，CD79a，CD79b和IgM陽性細胞較多，以分散或聚集的形式分布在整個器官中。在腸道中，CD79a、CD79b和IgM的分布有所差異，CD79a和CD79b陽性細胞主要分布在后腸的固有層中，少量分布于上皮細胞中，在前腸和中腸中未檢測到陽性信號。而IgM陽性信號主要集中在前腸和中腸的固有層中，后腸固有層中較少。除此之外，IgM陽性信號還可以在

8、后腸上皮層和中腸的漿膜層中檢測到表達。在鰓中，CD79a、CD79b和IgM陽性信號主要在鰓上皮細胞中檢測到表達。在皮膚中未檢測到陽性信號。
　　通過原核表達載體PET-28a和PET-16b-GFP分別構建了CD79a和CD79b重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達，純化得到重組蛋白。SDS-PAGE結果顯示：CD79a重組蛋白主要以包涵體形式表達，分子量大小約為30 KDa， CD79b重組蛋白主要以分泌形式表達

9、，分子量大小約為55 KDa。分別以CD79a和CD79b重組蛋白作為抗原，免疫5-6周齡Balb/c雌性小鼠和新西蘭大白兔得到相應抗血清，并通過細胞融合的方法制備了能分泌CD79a單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1-A5B1、1-D12H10和1-C5A4。Western blotting結果顯示：該抗體均可以與胭脂魚的頭腎提取液中分子量為25 KDa的蛋白發(fā)生特異性反應。
　　本研究獲得胭脂魚CD79a全長cDNA序列和CD