副溶血弧菌OpaR調(diào)控子調(diào)控生物膜的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一種革蘭陰性嗜鹽弧菌。常存在于近海岸海水、海產(chǎn)品及鹽漬食品中,日本、美國和東南亞國家是其主要分布地區(qū),是這些國家重要的食源性致病菌,當然也是我國沿海地區(qū)最常見的食物中毒病原菌,由VP菌引起的食物中毒案例約占這些地區(qū)食源性中毒案件的30％以上,浙江省則高達60％。當人們食用生的或烹煮不徹底的魚、蝦、蟹、貝等海產(chǎn)品時就有可能感染副溶血弧菌,表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉

2、等急性胃腸炎癥狀,嚴重者如治療不及時有可能發(fā)展成敗血癥,引起死亡。由于VP菌的廣泛流行和日益增高的中毒病例,很有必要對其致病機制進行深入研究。
　　 副溶血弧菌在生存過程中是能形成生物膜的,跟霍亂弧菌,哈氏弧菌及創(chuàng)傷弧菌一樣,生物膜在其適應環(huán)境和廣泛傳播過程中發(fā)揮著重要作用。副溶血弧菌OpaR,霍亂弧菌HapR及創(chuàng)傷弧菌SmcR均是哈氏弧菌LuxR的同源物,四者同為QS系統(tǒng)核心調(diào)控子。QS系統(tǒng)常常涉及到生物膜的形成,已有霍亂弧菌

3、HapR調(diào)控生物膜形成的報道。早期的研究表明OpaR基因調(diào)控細菌的透明度和群集性爬動,但對其調(diào)控生物膜形成的詳細機制研究少見。
　　 目的:本研究目的在于探究副溶血弧菌RIMD2210633 OpaR調(diào)控子控制的生物膜表型,鑒定其靶基因,尤其是直接調(diào)控的靶基因,進一步研究OpaR對其下游直接靶基因的精細調(diào)控機制。
　　 方法:本研究首先用自殺載體PDS132同源重組的方法敲除OpaR調(diào)控子,構建副溶血弧菌RIMD2210

4、633菌株的ΔOpaR無痕突變株,然后比較野生株和Δ OpaR突變株在透明度、生長曲線及生物膜形成的一系列表型實驗結果。其中生長曲線比較營養(yǎng)不同的M和MV5培養(yǎng)基在24℃和37℃兩個溫度下的生長狀態(tài),結晶紫染色作為生物膜定量分析方法。同時采用含His標簽的pET28a為載體,大腸桿菌菌株BL21(DE3)為表達宿主,用實驗室傳統(tǒng)的重組克隆方法表達OpaR蛋白,鎳柱純化得到高純度的His-OpaR蛋白,對其DNA結合活性進行分析:首先與其

5、直系同源物進行序列比對,然后對自身基因及推定的生物膜相關基因啟動子區(qū)設計引物進行EMSA,檢測這些靶基因啟動子區(qū)與Hs-OpaR蛋白結合活性,接下來的DNaseⅠ足跡實驗則對二者結合區(qū)域作序列上的分析。
　　 結果:用自殺載體PDS132同源重組的方法成功構建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的Δ OpaR無痕突變株。表型實驗中,在透明度分析上,Δ OpaR突變株是透明的,而野生株不透明,與文獻相符；從生長曲線看,二者在富營養(yǎng)

6、的M培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)無明顯差異,而在低營養(yǎng)的MV5培養(yǎng)基,Δ OpaR無痕突變株生長狀態(tài)比野生株好；生物膜結晶紫染色結果示△OpaR突變株生物膜形成能力要強于野生株。同時成功表達純化了His-OpaR蛋白,序列比對結果示其與另三種弧菌的直系同源物存在高度同源性,自身基因OpaR(VP2516)及生物膜相關基因scrG(VP1377)的EMSA和DNaseⅠ足跡實驗看出其有較高的DNA結合活性,同時也明確了它們與His-OpaR蛋白的結

7、合序列,說明這兩個基因受OpaR調(diào)控。
　　 結論:本研究成功構建了副溶血弧菌RIMD2210633菌株的ΔOpaR無痕突變株,搭建了基于自殺載體的VP菌基因敲除方法的平臺；生長曲線提示低營養(yǎng)條件下,OpaR基因能影響其生長狀態(tài)；通過生物膜結晶紫染色估計OpaR可能通過某種機制抑制生物形成；EMSA和DNaseⅠ足跡實驗說明OpaR作為QS系統(tǒng)的核心調(diào)控子,其具較高的DNA結合活性,DNaseⅠ足跡實驗也明確了OpaR(VP25